實(shí)驗(yàn)室常用豬精液的低溫保存方法

曹丹　馬永和　張永平

隨著養(yǎng)豬生產(chǎn)的發(fā)展和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程的推進(jìn)。人們對(duì)豬人工授精重要性的認(rèn)識(shí)越來(lái)越深刻，在現(xiàn)代養(yǎng)豬生產(chǎn)和育種工作中，人工授精正成為一種非常重要的生產(chǎn)途徑。在豬的生產(chǎn)方面，人工授精技術(shù)的應(yīng)用低溫保存與冷凍精液相比，具有更好的受胎率和產(chǎn)仔數(shù)，而且操作簡(jiǎn)單，取材方面，更利用推廣應(yīng)用。現(xiàn)將總結(jié)的豬精液的低溫保存方法介紹如下：

1 精液的采集

用38°C左右的熱水預(yù)熱集精杯，并將杯內(nèi)套入食品級(jí)塑料袋，并將消毒好的四層濾紙罩在杯口上，用橡皮筋套住。采用手握法采集精液，邊采集邊濾掉膠狀物，精液采集后要立即丟掉濾紙，蓋好杯蓋，送往實(shí)驗(yàn)室檢查。

2 精液品質(zhì)的檢查

采集精液后，迅速置于30°C左右的恒溫水浴中，然后取樣進(jìn)行品質(zhì)檢查，精子活力在70%以上，且無(wú)異味，乳白色，方可用于保存或輸精。

3 精液的稀釋和保存

3.1 低溫保存稀釋液的配制

準(zhǔn)確稱取如下藥品：葡萄糖2.5克、蔗糖3.3克、青霉素0.06克、鏈霉素0.1克、0.05%EDTANa2（乙二胺四乙酸二鈉），置入燒杯中。量取去離子水80毫升將其溶解后，攪拌至少30分鐘，分裝于離心管內(nèi)（規(guī)格50毫升）。離心機(jī)以7276倍重力，離心30分鐘后，取其上清液分裝于5毫升的離心管內(nèi)，置于4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

3.2 精液的第一次降溫、離心和稀釋

把盛有符合要求的精液（存活率70%以上）塑料瓶用4層毛巾包裹好后，置于17°C的冰箱中進(jìn)行1小時(shí)的降溫。精液經(jīng)降溫處理后，分裝于50毫升的離心管中，以250倍重力離心8分鐘。收集上清液置于滅菌的塑料瓶?jī)?nèi)，再次置入冰箱內(nèi)（17°C）內(nèi)靜置30分鐘。用離心管（規(guī)格5毫升）分裝，每個(gè)離心管內(nèi)裝入精液1毫升，用低溫保存稀釋液1∶2進(jìn)行同溫稀釋。

3.3 精液的二次降溫和4°C低溫保存

用四層毛巾將精液離心管進(jìn)行保溫處理后，放入冰箱內(nèi)（4°C）進(jìn)行緩慢降溫。觀察離心管中的精液溫度降到4°C時(shí)，將上述處理的離心管置入到4°C的恒溫水中保存。

4 低溫保存精液的使用

從冰箱中取出保存的精液，移液器移取50微升注入1.5毫升的離心管內(nèi)，添加同溫的低溫保存稀釋液1毫升，緩慢混合均勻后，置入35～37°C水浴鍋中孵育15分鐘。取10微升稀釋后的精液在血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上壓片，并于37°C載物臺(tái)上觀察精子活力等相關(guān)指標(biāo)。

5 低溫保存方式的機(jī)理探討

在0～5°C條件下，精子的活力被抑制，降低代謝水平，減少能耗，精子的存活時(shí)間得以延長(zhǎng)。在低溫保存下，10～0°C溫度范圍對(duì)精子是一個(gè)危險(xiǎn)的溫度范圍區(qū)，如果精液從常溫狀態(tài)迅速降至0°C，精子就會(huì)發(fā)生不可逆的冷休克現(xiàn)象。所以精液在低溫保存之前，需經(jīng)預(yù)冷平衡。其具體做法為：每分鐘降溫0.2°C，用1～2小時(shí)完成降溫全過程。