毛蕊異黃酮對人乳腺癌細胞增殖及凋亡的作用及機制研究*

曾文鄲 苗慧 任倩瑤△

(1. 桂林醫學院基礎醫學院實驗教學中心；2. 桂林醫學院廣西腫瘤免疫與微環境腫瘤實驗室，廣西 桂林 541004)

乳腺癌作為嚴重威脅世界女性健康的殺手之一，占女性所患惡性腫瘤的13.7%，且發病率逐年攀升[1]。雖然現代醫學對乳腺癌的診治工作取得了顯著進展，但耐藥現象明顯，易導致乳腺癌復發、轉移[2]。因此，尋求安全有效的新型藥物，改善乳腺癌微環境，提高治療效果，是當今乳腺癌研究的熱點，因此是從植物、水果和蔬菜中提取出來的非甾體類化合物，分為黃豆素類、木酚素類和異黃酮類三種，其化學結構與內源性雌激素極為相似[3]，因此具有雌激素樣作用，可用于治療激素類疾病，如心血管疾病、卵巢癌、乳腺癌[4]等。研究表明，毛蕊異黃酮作為一種從中藥黃芪中分離出來的異黃酮類植物雌激素，具有多種潛在的藥理活性。本課題組一直致力于毛蕊異黃酮對腫瘤細胞的研究工作，發現毛蕊異黃酮能夠抑制ER(-)乳腺癌、結直腸癌細胞的增殖并誘導凋亡[5]，但是對ER(+)乳腺癌細胞的研究甚少。本研究擬探討毛蕊異黃酮對ER(+)乳腺癌細胞增殖能力的影響及其可能的信號通路調控機制，為臨床乳腺癌的治療提供新的研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人乳腺癌細胞株MCF-7、T47D購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心；毛蕊異黃酮(純度>98%)購自成都普瑞法有限公司，濃度梯度分別為0、25、50、100 μM溶于DMSO，4℃保存；DMEM培養基、10%FBS胎牛血清、青鏈霉素、胰酶購自Gibco公司；CCK8試劑購自Sigma公司；Hoechst 33258凋亡染色試劑盒購自江蘇碧云天生物技術研究所；Annexin V/FITC流式細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司；4%多聚甲醛溶液、30%丙烯酰胺、Glycine、APS、SDS購自北京索萊寶科技有限公司；ERK1/2、p-ERK1/2一抗購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養

ER陽性人乳腺癌細胞株MCF-7、T47D均為本實驗室保存，均用含有10%FBS胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養基進行細胞培養，培養條件為37℃，CO2含量為5%。

1.2.2CCK8生長曲線

分別取對數生長期細胞，經胰蛋白酶消化后接種于96孔板中，接種體積為100 μL·孔-1，接種密度為3×105·孔-1。細胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、25、50、100 μM)的培養基，每種濃度設5個復孔，繼續培養不同時間后(0、24、48、72 h)，每孔加入CCK8試劑10 μL溶液，靜置4 h，溫度37 ℃，孵育1 h后，在450 nm波長下用酶標儀檢測吸光度。細胞抑制率(%)=(1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值)×100%。實驗重復3次。

1.2.3Hoechst 33258熒光染色法

分別取對數生長期細胞，經胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，接種體積為2 mL·孔-1，接種密度為5×105·孔-1。細胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、50、100 μM)的培養基，每種濃度設3個復孔，繼續培養48 h后，吸盡孔內培養基，加入4%多聚甲醛固定液0.5 mL，10 min后去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，避光染色5 min后，吸除Hoechst 33258染色液，用PBS洗2次，每次3 min。在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態，記錄細胞凋亡情況。實驗重復3次。

1.2.4流式細胞術

分別取對數生長期細胞，經胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，接種體積為2 mL·孔-1，接種密度為5×105·孔-1。細胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、50、100 μM)的培養基，每種濃度設3個復孔，繼續培養48 h后，PBS洗滌2次，調整細胞密度為1×106·mL-1，制成單細胞懸液，加入100 μL Binding Buffer和10μL FITC標記的Annexin-V，室溫避光30 min，再加入5 μL PI，避光5 min后，加入400 μL Binding Buffer，立即用FACScan進行流式細胞術定量檢測。實驗重復3次。

1.2.5Western blotting法

分別取對數生長期細胞，經胰蛋白酶消化后接種于6孔板中，接種體積為2 mL·孔-1，接種密度為5×105·孔-1。細胞貼壁之后，更換含有不同濃度毛蕊異黃酮(0、50、100 μM)的培養基，每種濃度設3個復孔，繼續培養48h后，用蛋白提取試劑盒按操作說明提取細胞總蛋白，紫外線分光光度計測定蛋白濃度后煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳，電轉4h至PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別孵育ERK1/2、p-ERK1/2一抗單克隆抗體(1：1000)，4 ℃過夜，TBST洗膜三次，加入二抗(1：5000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，加入ECL plus發光劑，顯色，暗室曝光，計算機定量分析。實驗重復3次。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 毛蕊異黃酮對MCF-7、T47D細胞增殖的影響

25、50、100 μM毛蕊異黃酮處理MCF-7、T47D細胞，CCK8實驗結果顯示，細胞增殖過程均受到毛蕊異黃酮的抑制，并呈劑量和時間依賴性(P<0.05)。同時，經100 μM毛蕊異黃酮濃度處理72 h后，MCF-7、T47D細胞增殖的抑制效果最為明顯(P<0.05)，見圖1。

圖1 CCK8檢測不同濃度毛蕊異黃酮對MCF-7、T47D細胞增殖的影響

2.2 毛蕊異黃酮對MCF-7、T47D細胞凋亡的影響

50、100 μM毛蕊異黃酮作用MCF-7、T47D細胞48 h后，Hoechst 33258熒光染色顯示，隨著毛蕊異黃酮藥物濃度升高，細胞內出現核固縮，并且核碎裂與凋亡小體明顯增加，呈劑量依賴性(P<0.05)，見圖2。流式細胞術檢測結果表明，MCF-7、T47D細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率隨藥物濃度升高而增高，100 μM毛蕊異黃酮對細胞促凋亡效應更為顯著(P<0.05)，見圖3。

圖2 Hoechst染色測定不同濃度毛蕊異黃酮對MCF-7、T47D細胞凋亡的影響(×400)

圖3 流式細胞術檢測不同濃度毛蕊異黃酮對MCF-7、T47D細胞凋亡的影響

2.3 毛蕊異黃酮對ERK1/2蛋白磷酸化水平的影響

50、100 μM毛蕊異黃酮作用乳腺癌MCF-7細胞48h后，Western blotting結果顯示，與對照組相比，50、100 μM毛蕊異黃酮藥物組中的p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達比值明顯降低，并且這種抑制水平隨著毛蕊異黃酮濃度的升高而增加，表明其具有劑量依賴性(P<0.05)，見圖4。

圖4 Western blottin檢測不同濃度毛蕊異黃酮對ERK1/2蛋白磷酸化表達水平的影響注：A-MCF-7乳腺癌細胞中p-ERK1/2蛋白相對表達量；B-蛋白質灰度值掃描統計；p-ERK1/2與ERK1/2蛋白表達相比，* P<0.05。

3 討論

植物雌激素與哺乳動物體內雌激素，無論在化學結構和生物活性方面都十分相似，能夠發揮類雌激素和抗雌激素雙向調節作用[6]。據研究表明，多種植物雌激素可以通過調節腫瘤侵襲轉移相關因子的表達，抑制癌細胞的遷移侵襲能力[7,8]。毛蕊異黃酮是一種典型的植物雌激素，可以通過結合雌激素受體調控相關信號通路的表達，發揮抗腫瘤、抗炎等多種功效[9]。值得注意的是，我們之前的研究已經證明植物雌激素毛蕊異黃酮成功地抑制了ER(-)乳腺癌細胞的增殖和侵襲能力。但毛蕊異黃酮是否對ER(+)乳腺癌細胞具有相同的誘導作用，其涉及的具體機制如何，這些都有待進一步地研究。

基于此原因，本研究中毛蕊異黃酮明顯抑制ER陽性人乳腺癌MCF-7、T47D細胞增殖，且呈時間和劑量依賴性，具體表現為隨著藥物濃度和作用時間的增加，細胞的增殖抑制率增高。同時，經毛蕊異黃酮處理后的乳腺癌MCF-7、T47D細胞，從形態學和分子生物學層面均出現凋亡細胞數目增多，凋亡率增加，呈現劑量依賴性。特別是在藥物濃度為100 μM毛蕊異黃酮時，細胞增殖抑制率和凋亡率效果顯著。

細胞外調節蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)是MAPK家族中的主要成員，是細胞信號傳導的重要途徑，其激活級聯反應已被廣泛研究。ERK1/2磷酸化后即p-ERK1/2，能夠將多種細胞外信號通過磷酸化活化逐級傳遞至細胞核，作用于細胞內的生長因子、細胞因子、腫瘤啟動因子，例如Elk-1、c-myc、c-fos、c-jun、NF-κB等轉錄因子和其他蛋白激酶底物[10]。ERK1/2的激活能夠參與調控有絲分裂、減數分裂等功能，與細胞生長、增殖、分化、遷移和存活密切相關[11]。在乳腺癌與MAPK信號通路關系的研究中發現，p-ERK1/2蛋白高表達存在于乳腺癌中；而當MAPK通路被抑制時，p-ERK1/2蛋白表達則下降[12]。我們的研究結果與之前的研究結果相吻合，當不同濃度毛蕊異黃酮處理乳腺癌MCF-7、T47D細胞后，p-ERK1/2 / ERK1/2比值下降，并呈劑量依賴性，提示毛蕊異黃酮可以降低ERK1/2磷酸化蛋白水平，從而抑制MAPK通路的活性。

綜上所述，毛蕊異黃酮能夠抑制乳腺癌MCF-7、T47D細胞的增殖和誘導其凋亡的作用，其機制可能是通過抑制MAPK通路的激活而實現的。毛蕊異黃酮在乳腺癌的治療中存在廣泛的應用前景，本研究為毛蕊異黃酮作為抗乳腺癌藥物提供了一定的實驗依據。