薰衣草精油治療小鼠燒傷的實驗研究

劉文彬 齊一凡 曹軍 吳喜成 周黎明

(1. 四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)2015級；2. 華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，四川 成都 610041)

薰衣草(LavandulaaspicL)是唇形科(Lamiaceae)的一種強烈芳香的灌木植物，傳統(tǒng)上用于治療多種皮膚病，包括燒傷和潰瘍等。薰衣草精油對傷口愈合具有一定的保護作用，不僅能促進創(chuàng)面組織修復(fù)、縮短愈合時間，而且可以抗炎、止痛，甚至減少瘢痕組織增生[1]。同時在治療過程中散發(fā)著薰衣草的清香，增添了芳香療法的新理念，可在一定程度上克服傳統(tǒng)治療過程中患者痛苦及情緒煩躁不安的缺點。已有研究證實了薰衣草精油具有抗炎、止痛，減少瘢痕組織增生，促進創(chuàng)面組織修復(fù)、縮短愈合時間的作用[2]，本實驗構(gòu)建小鼠燒傷模型，擬探究薰衣草精油對小鼠皮膚燒傷的治療效果，為薰衣草精油臨床使用拓展適應(yīng)癥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物

自成都達碩生物科技有限公司購得48只SPF級KM雄性小鼠，體重25±2 g，批號：SCXK(川)2015-030，分籠飼養(yǎng)，每籠5只。飼養(yǎng)條件：室內(nèi)溫度 23±1oC，相對濕度50%±5%，自由飲食水，光暗周期為12/12 h。

1.1.2儀器與試劑

實驗室自制小鼠背部暴露固定器與手持式長柄阻燃壓板燒傷裝置；KD-BM包埋機(北京佳源興業(yè)科技有限公司)；奧林巴斯CX23顯微鏡(北京瑞科中儀)；10% 水合氯醛；金萬紅軟膏(天津達仁堂京萬紅藥業(yè)有限公司，批號：Z12020440)；薰衣草精油(濃度98%，上海三抒生物科技有限公司，批號：QC20170611)；6% 硫化鈉；95% 乙醇。

1.2 方法

1.2.1隨機分組

按隨機取樣的原則分為5組，其中完全空白組8只，不做任何處理；模型組、甘油組、金萬紅組和薰衣草精油組各10只，分別制備脫毛并燒傷模型。

1.2.2燒傷模型

實驗前一天，用10% 水合氯醛麻醉(5×10-3mL·g-1)麻醉小鼠(下同)，用固定器固定，暴露背部4×4 cm區(qū)域。剪刀剪短背部鼠毛，用棉簽蘸取6%硫化鈉均勻涂抹，直到細毛脫落并裸露小鼠背部光滑表皮。一人將燒傷裝置壓于小鼠背部無毛部位，暴露出1.5×2 cm的燒傷窗口，裝置與鼠背間不可留有空隙。助手在窗口內(nèi)滴加95%乙醇，浸滿窗口內(nèi)皮膚并不漏液。打火機點火，啟動秒記時，到20 s[2]時用濕紗布熄火。將小鼠從裝置中取出，用吹風(fēng)機吹干后放回鼠籠。注意保暖與護理，降低死亡率。當(dāng)天腹腔注射生理鹽水0.4 ml，次日口服牛奶 0.2-0.3 ml[3,4]。

圖1 裝置示意圖注：A：自制手持式長柄阻燃壓板燒傷裝置；B：自制小鼠背部暴露固定器

1.2.3實驗動物分組及治療

模型組不給任何藥物，其余各組自燒傷第2天起每日給2次藥(除第2天處死取樣的小鼠)，甘油組每只涂抹60% 甘油水溶液0.2 ml，金萬紅組每次涂抹金萬紅軟膏覆蓋燒傷區(qū)域，薰衣草精油組每只涂抹薰衣草精油0.2 ml。共給8天藥，每天正常飼養(yǎng)。

1.2.4皮膚病理學(xué)檢查

于燒傷后第2、4、6、8日各組分別處死1、2、3、3只小鼠，取燒傷部分皮膚做病理學(xué)檢查。

取樣方法：處死小鼠，將燒傷區(qū)域連同周邊正常皮膚約半厘米剪下，平鋪于小片濾紙上，折疊后置于包埋盒中，浸泡于10% 福爾馬林固定。完成固定后，切取4 mm×4 mm×5 μm的一塊皮膚，制備石蠟切片，HE染色后，用顯微鏡觀察并照相[5,6,7]。

1.3 病理學(xué)評分

標準參考A. Eldad，A. einberg[8〗(表2)，依此對樣本進行病理評分，采取盲評、平行評分原則。評分結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析。

表1 顯微鏡下病理評分標準

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察

自第2日起，模型組創(chuàng)面結(jié)一層深棕色干痂；第6天，創(chuàng)面形成一層厚厚的深茶色干痂，難以揭除，痂下有積液；第8天，創(chuàng)面明顯縮小，周圍有上皮向內(nèi)生長，但厚焦痂仍不易揭除，痂為肉芽創(chuàng)面。而治療后各組(甘油組,京萬紅組和薰衣草精油組)自第2日起創(chuàng)面結(jié)痂，顏色淺，周圍可見液體滲出；第6天，液體逐漸減少，干痂可部分揭除，尤其在第8天，創(chuàng)面明顯縮小，周圍上皮增生明顯，幾乎覆蓋創(chuàng)面，干痂可以大部分或全部揭除。

2.2 顯微鏡下觀察

以第八天病理標本為例，可得鏡下結(jié)果圖2示。可以看出：相較于模型組，經(jīng)過8天的治療，金萬紅組和薰衣草精油組均有不錯的治療效果，表皮明顯再生，白細胞輕度浸潤，真皮表皮連接明顯修復(fù)，鏡下幾乎看不到水泡。

2.3 病理評分結(jié)果

表2 病理評分結(jié)果

注：與模型組相比，*p<0.05 ；與薰衣草精油組相比，#p<0.05。

圖2 第8天各組小鼠背部燒傷上皮組織HE染色(400×)注：A：空白對照組圖(星號：上皮完整；箭頭：真皮-表皮連接完整)；B：模型組(星號：上皮全部損壞/缺失；箭頭：<25%的真皮-表皮連接，有微水皰)；C：甘油組(星號：上皮部分壞死/潰瘍；箭頭：25%-50%真皮-表皮連接，有微水皰)；D：京萬紅組(星號：上皮輕度壞死；箭頭：25%-50%真皮-表皮連接，有微水皰)；E：薰衣草精油組(星號：輕度部分壞死；箭頭：50%-75%真皮-表皮連接，無微水皰)

整體觀察，從起效時間來看，與模型組相比，三個給藥組起效順序為薰衣草精油組、甘油組和金萬紅組，分別在燒傷后第4天、第6天、第8天起作用，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；從效果來看，燒傷后第6天薰衣草精油對燒傷的治療作用要優(yōu)于甘油(P<0.05)；第8天薰衣草精油對燒傷的治療作用要優(yōu)于甘油組和京萬紅組(P<0.05)。

綜上所述，本實驗通過大體標本和鏡下標本的觀察及對標本的病理評分，可以得出：薰衣草精油和金萬紅對燒傷均有良好的治愈效果，且薰衣草精油比京萬紅起效更快。

3 討論

本次實驗在復(fù)制燒傷小鼠模型的前期過程中，我們參考了已有文獻中[2]的造模方法，發(fā)現(xiàn)效果并不理想，由此進行了改進。實驗中采用小電推子脫毛、硬紙片固定燒傷面積、使用酒精點燃的方法進行造模，但由于皮膚毛根的殘留導(dǎo)致火勢不均，難以達到理想的燒傷效果。我們再的改進辦法是使用6%的硫化鈉溶液脫毛，以保證毛根也能清除干凈，使火焰能夠完全燒灼皮膚。此外，較長時間的麻醉、脫水，導(dǎo)致小鼠腦部血液循環(huán)不暢，眼睛干涸造模完成后老鼠失明，給后續(xù)實驗造成了不穩(wěn)定的因素。我們的解決辦法是事先在眼球上涂抹眼膏，以保持小鼠眼球濕潤防止失明。

燒傷破損面的愈合是自然生理過程，是對受損皮膚組織的功能和完整性的恢復(fù)。該過程分為四個重疊階段：即凝血、炎癥、新組織形成和組織重塑，特別是新的組織形成和組織重塑。不同細胞和細胞因子、炎癥介質(zhì)參與了創(chuàng)面愈合的各個過程，參與的細胞主要有角化細胞、纖維母細胞、內(nèi)皮細胞、巨噬細胞及血小板等。細胞因子包括：生長因子、腫瘤壞死因子、干擾素、集落刺激因子、趨化因子、白細胞介素。凝血階段主要由血小板、纖維蛋白完成；炎癥反應(yīng)階段主要有中性粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等參與；增殖期主要由成纖維細胞、內(nèi)皮細胞、上皮細胞及膠原完成，重塑期主要是膠原纖維的收縮及瘢痕形成[9,10]。

薰衣草精油的主要成分為芳樟醇和乙酸芳樟酯，次要成分為包括β-羅勒烯在內(nèi)的12種成分。已有研究表明薰衣草精油能夠治療燒傷可能與其具有抗炎和抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)[11]。本次試驗中，進行治療第4，6，8天時薰衣草精油的療效優(yōu)于京萬紅，可能是由于用薰衣草精油在燒傷愈合過程中提高了相關(guān)細胞和細胞因子的表達，促進了成纖維細胞的膠原成熟和合成，并在傷口損傷中誘導(dǎo)I型和III型膠原的表達。

目前臨床上較多使用的治療燒傷的藥物是磺胺嘧啶銀和京萬紅軟膏，但也有其缺點：部分病人會發(fā)生磺胺過敏反應(yīng)。結(jié)合我們的實驗結(jié)論，薰衣草精油治療燒傷的效果同樣顯著，有望作為已有陽性藥的替代藥物使用。相關(guān)的研究將在后續(xù)試驗中進行。