農桿菌介導的甜椒遺傳轉化體系的建立

蘇振華,張俊華,張澤鑫,李妹芳,郭尚敬,曹雪松,冀蘆沙,3*

(1.聊城大學 生命科學學院，山東 聊城 252000；2.聊城大學 農學院，山東 聊城 252000；3.聊城大學 藥學院，山東 聊城 252000)

隨著生命科學的蓬勃發展，分子生物學和基因工程也取得了長足的進步。根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)介導的外源基因轉化方法[1]，由于其可導入大片段DNA且導入基因拷貝數低，高轉化率且表達效果好，引起了人們的極大關注[2]；同時由于其對儀器和操作技術要求較低，被廣泛應用于植物基因工程中，用于研究未知基因功能、各種基因調控原件的機理等。目前，已知的80%的轉基因植物是通過農桿菌介導完成的[3-4]。目前番茄、煙草、馬鈴薯等多數作物的轉基因技術已日趨完善[5-7]，實用化程度不斷提高，而甜椒的遺傳轉化還不是十分完善，其轉化效率較低，且由于其遺傳背景較為狹窄，存在著較強的基因型依賴性，極大地限制了甜椒基因工程遺傳改良的步伐和辣椒功能基因組學研究。因此，本實驗通過研究不同因子對甜椒轉化效率的影響，優化了甜椒遺傳轉化體系，旨在建立高效快速的農桿菌介導的甜椒遺傳轉化技術體系,為甜椒進一步的分子生物學和基因工程研究提供較好的技術支撐。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 甜椒品種 低溫滲透系甜椒CL122，由聊城大學植物分子生物學實驗室根據野生甜椒CA157與栽培甜椒CA52篩選育成。

1.1.2 根癌農桿菌菌株與載體 根癌農桿菌GV 3101(KanR)：攜帶植物表達載體pCAMBIA-1301-GFP(抗性標記為抗卡那霉素)。

1.1.3 培養基 農桿菌培養基：液/固體LB培養基+Kan 100 mg/L+Rif 50 mg/L；組織培養培養基：基本培養基MS、1/2MS。

1.2 實驗方法

1.2.1 基本培養條件 培養溫度：(25±1) ℃；光照強度：2000～2200 lx、16 h/d，光源為熒光燈。設置3次重復，每次處理外植體個數為30個。

1.2.2 農桿菌侵染液的制備 將含有目的基因的農桿菌劃線接種于含有100 mg/L Kan+50 mg/L Rif的LB培養基上，28 ℃暗培養2 d至長出單菌落。隨后挑取單菌落轉接至含有100 mg/L Kan+50 mg/LRif的5 mL液體LB培養基中，在200 r/min、28 ℃條件下培養16 h后，轉接至含有100 mg/L Kan+50 mg/L Rif的50 mL液體培養基中，繼續培養至對數生長期OD600≌0.6～1.0；以5000 r/min集菌，使用侵染緩沖液將其懸浮至OD600=0.6，4 ℃保存。

1.2.3 外植體準備 將甜椒種子用水浸泡8～10 h，流水清洗30 min，用無菌水沖洗2～4次，然后于超凈工作臺上用75%酒精消毒1 min，再用20%的84液和0.02%的TritonX-100 1∶1混合液，以180 r/min震蕩消毒10 min，用無菌水沖洗4～6次。將消毒除菌的甜椒種子接種于不含任何生長激素的1/2MS培養基上，25 ℃、16 h/d 光照(2000 lx)培養，6～7 d 后得到未長出子葉、帶有子葉節的無菌苗。

1.2.4 影響甜椒遺傳轉化效率的因素 在使用農桿菌對甜椒外植體進行侵染的過程中，影響因子包括：Kan選擇壓、農桿菌菌液濃度、AS濃度、預培養時間、侵染時間、共培養時間、不同激素濃度等。在實驗設計過程中，分別以某一因子為單一變量，其他因子以轉化程序為標準，觀察不同影響因子對甜椒再生效率和轉化效率的影響。

1.2.4.1 卡那霉素(Kan)選擇壓的確定 在超凈工作臺中，切取甜椒子葉節，將其作為外植體，接種至含有不同Kan濃度(0、25、50、75、100 mg/L)的生芽培養基上。每個濃度重復3次，每次處理外植體個數為30個。培養條件同無菌苗的培養，每隔10 d 進行繼代，于30 d后觀察外植體狀態，測定愈傷誘導率和平均每個外植體抗性芽數。

愈傷誘導率(%)=(產生愈傷的外植體數/總外植體數)×100%

平均每個外植體抗性芽數=抗性芽數總數/外植體總數

1.2.4.2 AS濃度的確定 基本條件同1.2.4.1，設置的AS濃度分別為0、50、100、150、200、300、500 μmol/L。

1.2.4.3 預培養時間的確定 切取甜椒子葉節作為遺傳轉化的外植體，將外植體接種至含有2.0 mg/L AgNO3+2.0 mg/L 6-BA的MS預培養培養基，置于25 ℃暗培養培養箱，分別培養0～5 d，每個時間處理重復3次，每次處理外植體個數為30個。

1.2.4.4 農桿菌侵染時間的確定 使用制備好的農桿菌侵染緩沖液侵染預培養的甜椒外植體，為保證侵染時間一致，可先將外植體取出，放置于滅菌的濾紙上，再將所有外植體同時放入侵染緩沖液中，侵染時間分別為0、5、10、15、20、25、30 min。取出經過侵染的外植體，將表面的菌液吸干，將其放入共培養培養基(MS+2 mg/L 6-BA+2 mg/L AgNO3+100 μmol/L AS)，25 ℃暗培養2 d，每種時間處理重復3次，每次處理外植體個數為30個。

1.2.4.5 共培養時間的確定 農桿菌侵染外植體后，將被侵染的外植體轉接至共培養基，共培養時間分別為0、1、2、3、4、5 d。 25 ℃下，暗培養，每種時間重復3次，每次處理外植體個數為30個。

1.2.4.6 Timentin 抑菌濃度的選擇 在對農桿菌侵染后的外植體進行選擇和生根培養時，需要加入一定濃度的抗生素進行抑菌，同時因為Timentin具有抑菌作用且毒性較小，故在選擇和生根培養基中加入200 mg/L Timentin，對外植體生長和污染狀況進行觀察。

1.2.4.7 選擇培養及植株再生 共培養結束后，將外植體轉接至選擇培養基(MS+2.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L AgNO3+400 mg/L Timentin +Kan)中進行培養，根據不同Kan選擇壓，每種重復3次，每次重復外植體個數為 30個。培養條件為25 ℃，光照16 h/d 。

1.2.4.8 不同激素濃度的生根培養基 當選擇培養基中的外植體不定芽生長至1～2 cm時即可將其轉接至生根培養基，首先將其轉接至不同激素濃度的生根培養基，3～5 d后轉接至MS+400 mg/L Cef培養基中繼續生根培養。培養條件為25 ℃，光照16 h/d。

1.2.5 轉基因苗PCR檢測

1.2.5.1 轉基因苗DNA提取 按照以下步驟操作：(1)組織處理：收取轉基因甜椒葉片，放置于1.5 mL EP管中，通過高通量組織研磨儀進行研磨。(2)向EP管中加入500 μL SDS-DNA提取Buffer，充分混勻后65 ℃溫浴10 min。(3)常溫、12000 r/min 離心10 min，取上清。(4)加入等體積氯仿∶異戊醇(24∶1)，12000 r/min離心10 min，取上清。(5)加入0.5倍體積異丙醇，充分混勻，轉至吸附柱中，12000 r/min離心2min，棄廢液。重復2次。(6)向吸附柱中加入600 μL無水乙醇，12000 r/min離心30 s，棄廢液。重復兩次。(7)將吸附柱12000 r/min離心2 min，放入新EP管中。(8)向吸附柱中加入40 μL TE洗脫，12000 r/min離心2 min。

1.2.5.2 PCR檢測PCR反應體系：模板1.0 μL、20 μmol/L eGFP3′ 0.2 μL、20 μmol/L eGFP5′ 0.2 μL、Taq酶0.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、10×PCR buffer 2.0 μL、ddH2O 15.2 μL、總體積20.0 μL。

PCR反應條件：95 ℃ 5 min(預變性)、94 ℃ 30 s(變性)、59 ℃ 40 s(退火)、72 ℃ 40 s(延伸)、72 ℃ 5 min(延伸)、4 ℃冷卻；共30個循環。

2 結果與分析

2.1 卡那霉素(Kan)對甜椒外植體分化的影響

由表1可知，在甜椒進行遺傳轉化的過程中，Kan對甜椒外植體愈傷組織的形成與分化有明顯的影響，隨著培養基Kan濃度的提高，甜椒外植體愈傷誘導率與抗性芽數均明顯降低。當培養基中無Kan時，愈傷誘導率與抗性芽數均為最高，分別為73.33%和1.25個。當Kan濃度提高至75 mg/L時，外植體無法生成愈傷并停止分化。當Kan濃度為50 mg/L時，甜椒外植體愈傷誘導率和抗性芽數極低，分別為17.67%和0.13個，因此將此濃度定為甜椒外植體分化的最低抑制濃度，同時，確定Kan選擇壓為50 mg/L。

2.2 菌液中加入 AS 對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

AS是一種高效激素，一定濃度的AS可以提高外植體的愈傷誘導率和抗性芽數，并能夠提高農桿菌的侵染效率，提高轉化率。因此我們在菌液中加入不同濃度的AS，研究AS對甜椒外植體分化的影響。表2顯示，不同濃度AS對甜椒外植體的再生分化有一定的影響，并存在一定的差異。如表2所示，當AS濃度上升至100 μmol/L時，隨AS濃度增大，甜椒愈傷誘導率與抗性芽數均有增長，但在AS濃度大于100 μmol/L后，甜椒再生分化效率均有所降低，但多數均大于AS濃度為0時的數值，且當AS濃度為100 μmol/L時，甜椒外植體愈傷誘導率和抗性芽數均為最高，分別為73.33%和1.48個。由此說明一定濃度的AS可以促進外植體的再生與分化，且在100 μmol/L時效率最高。

表1 Kan對甜椒子葉節分化的影響

表2 菌液中加入 AS 對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

2.3 預培養時間對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

如表3所示，甜椒外植體的預培養時間對其愈傷誘導率影響較小，但各組數值均大于預培養時間為0時的愈傷誘導率；預培養時間對抗性芽數有明顯的影響，各組數值差異較大，在預培養2 d時外植體抗性芽數最多，且愈傷誘導率最高，由此確定最適宜的外植體預培養時間為2 d 。

2.4 農桿菌侵染時間對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

在構建甜椒遺傳轉化體系過程中，利用農桿菌侵染甜椒外植體是最為重要的過程，其中農桿菌侵染時間決定了外植體的再生分化效率。農桿菌侵染時間對甜椒外植體愈傷誘導率和抗性芽數的影響如表4所示，農桿菌侵染時間對甜椒外植體遺傳轉化效率的影響，呈現出先升高后降低的趨勢，并在侵染5 min時，愈傷誘導率和抗性芽數達到最高，分別為98.41%和1.87個，明顯高于其他處理時間下的；當侵染時間為0 min和11 min時，愈傷誘導率和抗性芽數明顯低于其他處理時間下的。由此說明，過短或過長侵染時間均不利于甜椒的遺傳轉化，且侵染最適時間為5 min。

表3 預培養時間對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

表4 農桿菌侵染時間對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

2.5 共培養時間對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

共培養時間是甜椒遺傳轉化效率的重要影響因素之一，是農桿菌將目的基因整合進入甜椒基因組的重要過程。把甜椒外植體侵染過后轉接至共培養培養基，研究共培養時間對甜椒外植體遺傳轉化效率的影響，結果見表5。隨著共培養時間的延長，甜椒外植體的再生分化效率呈現出先升高后降低的趨勢，并在2 d時達到最高，愈傷誘導率和抗性芽數分別為99.89%和1.79個；2 d后隨著時間的延長，農桿菌較難抑制，外植體污染率增大，致使愈傷誘導率和抗性芽數降低，因此選取共培養時間為2 d。

2.6 不同激素組合對甜椒子葉節遺傳轉化苗生根的影響

當外植體不定芽生長至1 cm左右時，選取生長狀況良好的不定芽，接種至含激素如表6所示的培養基，于該培養基25 ℃、16 h/d光照下培養，4 d后將不定芽轉接至含不同濃度激素的MS+400 mg/LTimentin的生根培養基。如表6所示，經MS+0.2 mg/L IAA+400 mg/L Timentin 培養4 d后轉接至生根培養基，此時外植體生根率最高，為100%，且可迅速生長形成植株，與其他不同激素組合有明顯差異。1～4號不同激素配比的培養基均沒有誘導外植體生根，只對愈傷組織產生了一定影響，差異較小。6、7號培養基雖然可以誘導生根，但同時會誘導產生大量愈傷組織，影響外植體根系發育，不利于植株生長。

表5 共培養時間對甜椒子葉節遺傳轉化效率的影響

表6 甜椒子葉節遺傳轉化苗生根效果

2.7 轉基因植株的獲取與檢測

2.7.1 轉基因植株的獲取 基礎實驗表明，最適的卡那霉素選擇壓為 50 mg/L，乙酰丁香酮濃度在100 μmol/L時可以明顯提高外植體的抗性芽數，2 d為最適合的預培養時間和共培養時間，5 min 作為侵染的最佳時間，在MS+0.2 mg/L IAA(吲哚乙酸)+400 mg/L 特美汀培養基上的生根率最高。因此，根據結果配置不同階段培養基(表7)，以獲取轉基因植株(圖1)。

表7 不同階段培養基成分

a：篩選培養基生成愈傷組織；b：篩選培養基生成再生芽；

2.7.2 轉基因植株檢測結果 對獲得的植株進行PCR鑒定，有12株植株擴增出750 bp左右與陽性對照相同的條帶，其他植株則擴增出與陰性對照相同的目的條帶(圖2)。通過熒光倒置顯微鏡對PCR鑒定結果為陽性的植株進行檢測，結果可以成功激發出綠色熒光(圖3)，表明綠色熒光蛋白基因已被成功整合到甜椒基因組中。

3 結論與討論

當前，利用農桿菌進行遺傳轉化已廣泛應用于多種轉基因植物的構建，農桿菌介導的遺傳轉化途徑可以實現外源基因的導入[4]，并已經在番茄[5]、馬鈴薯[6]、辣椒[7]等多種茄科植物中獲得成功。但由于在甜椒轉化過程中，其受環境等因素影響較大，目前還存在一些問題亟待解決，因此建立并逐步優化農桿菌介導的甜椒遺傳轉化體系是必需的。本實驗以甜椒再生體系為基礎，選取甜椒子葉節為遺傳轉化的外植體，對不同條件對甜椒遺傳轉化效率的影響進行研究，建立了一個高效穩定的甜椒遺傳轉化體系，并為下一步外源基因的導入，快速獲得甜椒突變體，研究基因功能等創造了條件。

1～18為轉基因植株，CK為未轉基因植株，CK1為陽性對照。

3.1 甜椒遺傳轉化中抗生素的篩選

在植物進行遺傳轉化的過程中，陽性轉化的篩選是一個重要的步驟[8]，篩選體系的確定直接影響陽性轉化植株的獲取。在農桿菌介導的遺傳轉化體系中，由于Kan毒性較小，且對農桿菌轉化有一定的針對性，所以研究者普遍使用Kan對陽性轉化進行篩選。在利用Kan對被農桿菌侵染的外植體進行篩選時，非轉化的外植體無法生長，而轉化成功的外植體可成功誘導愈傷，并且在適宜條件下可發育成為完整植株。因此，適宜的Kan選擇壓可以在不影響正常轉化植株的情況下，最大限度地抑制非轉化植株的生長，進而提高轉化效率。袁靜等[9]研究發現50 mg/L Kan 對辣椒外植體篩選濃度影響最佳；羅齊軍[10]認為辣椒外植體的最佳 Kan 篩選濃度是 35 mg/L。 本試驗研究發現甜椒遺傳轉化體系最合適的Kan選擇壓濃度為 50 mg/L。

圖3 熒光倒置顯微鏡468 nm激發甜椒葉片GFP熒光

3.2 預培養和共培養時間

遺傳轉化體系中的預培養和共培養時間的選擇尤為重要。預培養時間太長或太短，均不利于外植體的生長。羅齊軍[10]發現預培養 2 d 外植體生長良好，這與本試驗結果一樣，同時也和黎定軍[11]的研究結果一致。同時，如果共培養時間過短，則會導致侵染不充分，導致轉化效率的降低；如果共培養時間過長，由于共培養過程中沒有抑菌劑的加入，會導致外植體大量死亡。因此，有人也會在共培養后進行脫菌處理再進行篩選培養[12,13]，這也是為了防止農桿菌對外植體造成污染。

3.3 甜椒遺傳轉化中 AS 濃度的選擇

AS可以提高農桿菌侵染的轉化效率，常被用于農桿菌介導的植物轉化過程中[14-16]。Kim等[17]研究發現在利用農桿菌對辣椒進行遺傳轉化的過程中添加AS，可以明顯提高辣椒遺傳轉化效率，將其提高至95%以上；羅齊軍[10]研究發現在農桿菌介導的甜椒遺傳轉化體系中，在菌液和共培養基中加入 100 μmol/L AS可以顯著提高外植體愈傷誘導率和不定芽分化率。同時，楊國順等[18]認為最合適的AS濃度為200 μmol/L。本實驗在菌培養及共培養階段均添加了AS,得到了明顯高于對照組外植體分化再生效率的結果，并發現甜椒遺傳轉化體系中適宜的AS濃度為100 μmol/L。

3.4 侵染時間對甜椒遺傳轉化的影響

農桿菌侵染時間直接影響農桿菌的轉化效率，并與外植體誘導抗性芽數有密切關系。適宜的侵染時間十分重要，如果農桿菌侵染時間過長，則外植體上會有大量的農桿菌殘留，在后期的培養過程中，可能會出現，且難以控制，導致植株死亡；侵染時間過短，菌液與外植體接觸不夠充分，會降低轉化效率，導致大量非抗性苗出現。同時侵染時間的選擇也同菌液濃度有關，一般選擇菌液濃度OD600為0.3～0.5。黃妤等研究農桿菌侵染辣椒的最適時間為5 min[19]。也有人發現農桿菌侵染辣椒7～8 min 對再生頻率和抗性芽數影響效果最好[20]。經研究發現，甜椒遺傳轉化體系中最適合的侵染時間為5 min，且侵染時間不宜有太大變化。

3.5 抑菌劑(Timentin)濃度的選擇

Timentin作為一種抑菌劑，可以用來抑制農桿菌，同時由于其對外植體毒害作用較小，所以常用于農桿菌介導的植物遺傳轉化過程中。在實驗初始階段，進行生根培養時，由于沒有加入Timentin，出現了大量的植株污染現象。后經實驗發現，在生根過程中加入一定濃度的Timentin可以降低污染，同時轉化植株長勢良好，無黃葉出現。在本次試驗過程中我們主要是參考敬國興等對這一部分的研究[21]，如果 Timentin 濃度過低時，生長一段時間后農桿菌會大量再生，引起植株大量的污染，最后造成植株死亡。在試驗過程中研究發現在培養基中添加200 mg/L Timentin可以有效抑制農桿菌的生長。