殼聚糖傷口敷料無菌檢查方法的建立*

曹寒梅 ，楊曉莉 ，蔡 虎 ，常 春 ，傅 強 △

（1.西安交通大學藥學院，陜西 西安 710061； 2.陜西浩瀚管理技術咨詢有限公司，陜西 西安 710065；3.陜西省食品藥品監督檢驗研究院，陜西 西安 710065； 4.陜西省醫療器械質量監督檢驗院，陜西 咸陽 712046）

殼聚糖傷口敷料產品含有的殼聚糖，是甲殼素的脫乙酰產物，是廣泛存在于自然界的唯一堿性氨基多糖。殼聚糖抗菌譜廣，具有良好的抗菌特性，對金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、產氣莢膜桿菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、白色念珠菌等均有較好的抑制作用[1]。殼聚糖環境介質的pH越低，所帶氨基正電荷越多，抗菌活性也越強[2]。本研究中根據2015年版《中國藥典（四部）》通則1101“無菌檢查法”建立了殼聚糖傷口敷料的無菌檢查方法，以期為該敷料類醫療器械的檢驗提供參考。現報道如下。

1 儀器、試藥與材料

1.1 儀器

HF1500TE型生物安全柜（上海力申科學儀器有限公司）；LRH-250F型生化培養箱、MJ 250FI型霉菌培養箱（上海一恒科學儀器有限公司）；VORTEX-5型渦旋混合器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；LDZX-80KCS型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫療器械廠）。

1.2 試藥

殼聚糖傷口敷料（某生物科技有限公司，批號為150801，規格為50 mm×40 mm）；胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號為1702042）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號為1704064）、胰酪大豆胨液體培養基（批號為1703102）、硫乙醇酸鹽流體培養基（批號為160624）、沙氏葡萄糖液體培養基（批號為1505252），均購自北京三藥科技開發公司；氯化鈉（批號為20160601）、氫氧化鈉（批號為20160601），均購自天津市致遠化學試劑有限公司。

1.3 菌種

大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，金 黃 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，枯 草 芽 孢 桿 菌 （Bacillus subtilis）[CMCC（B）63501]，生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC（B）64941]，白 色 念 珠 菌 （Candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，均購自中國食品藥品檢定研究院，工作用菌株為第3代。

表1 無菌檢查結果（n=3）

2 方法與結果

2.1 菌液制備

大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌采用胰酪大豆胨液體培養基，于30～35℃條件下培養18～24 h；生孢梭菌采用硫乙醇酸鹽流體培養基，在30～35℃條件下培養18～24 h；白色念珠菌采用沙氏葡萄糖液體培養基，于20～25℃條件下培養24～48 h；黑曲霉采用沙氏葡萄糖瓊脂培養基，于20～25℃條件下培養5～7 d后，加入含0.05%聚山梨酯80的無菌0.9%氯化鈉溶液，將孢子洗脫。上述6株菌株采用10倍稀釋法制得每1 mL含菌數小于100 cfu的菌懸液。

2.2 方法適用性試驗

試驗管：取20包樣品，無菌操作，每包不同部位剪取1 cm×3 cm，接種于pH為7.6的硫乙醇酸鹽流體培養基300 mL（滅菌前加入適量1 mol／L的NaOH溶液，使滅菌后的培養基pH為7.6±0.2），平行操作3次；取1 mL 2.1項下大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、生孢梭菌菌懸液分別接入其中。另取20包樣品，無菌操作，每包剪取1 cm×3 cm，于pH為7.6的胰酪大豆胨液體培養基200 mL（滅菌前加入適量1 mol／L的NaOH溶液，使滅菌后的培養基pH為7.6±0.2）中，平行操作3次；取1 mL 2.1項下枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉試驗菌分別接入其中。同時測定接種的菌數，吸取制得的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌試驗菌懸液1 mL，置90 mm無菌平皿中，傾注溫度不超過45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養基，混勻，凝固，于35℃下倒置培養、計數。量取白色念珠菌和黑曲霉試驗菌懸液1 mL，置90 mm無菌平皿中，傾注溫度不超過45℃融化的沙氏葡萄糖瓊脂培養基，混勻，凝固，于25℃下倒置培養、計數。量取生孢梭菌試驗菌1 mL，直接接種到12 mL硫乙醇酸鹽流體培養管中，于35℃條件下靜置培養、計數[3-5]。

對照管：不加入樣品，依法試驗。

陰性對照管：不接入菌，按試驗組方法，制備2管。

上述硫乙醇酸鹽流體培養基30～35℃，胰酪大豆胨液體培養基20～25℃，培養時間不超過5d，逐日觀察，陰性對照組無菌生長；培養1 d后，試驗組和對照組試驗菌均生長良好。調節培養基pH為7.6（堿性），可以有效消除殼聚糖的抑菌性。結果見表1。

3 討論

殼聚糖能抑制多種細菌的生長與活性，可能是因為殼聚糖中含有大量的正電基團，對帶有負電荷細菌的電荷平衡造成破壞，抑制細菌的活性。在pH為7.6時，殼聚糖不再具有抗菌效果，這是由于不帶電荷的氨基酸殘基比例的增加及與其更低的可溶性所致。已有文獻試驗證明，添加金屬離子對殼聚糖抗菌性的影響，如鈉離子、鎂離子，濃度越高，殼聚糖抗菌活性越低，這可能與金屬離子能和殼聚糖形成螯合物有關。同時，陰離子表面活性劑的加入也能使殼聚糖抗菌活性下降，這可能是因為殼聚糖分子中的帶正電的氨基與表面活性劑中的陰離子結合，降低了抗菌基團的數量，從而降低了抗菌活性[6]。