高效液相色譜法測定心可寧膠囊中4種皂苷含量

趙袁豐 ，龔竹青 ，趙義雄，吳 杰

（1.貴州省黔東南苗族侗族自治州人民醫院，貴州 黔東南 556000； 2.貴州飛云嶺藥業股份有限公司，貴州 黔東南 556000）

心可寧膠囊是由丹參、三七、冰片、人參須等8味中藥材組方，收載于衛生部藥品標準[1]，具有活血化瘀、開竅止痛功效，臨床主要用于治療冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。ê喎Q冠心?。?、心絞痛、胸悶等疾病。原質量標準僅對方中成分丹參、牛黃和蟾酥進行了定性鑒別。近年來對心可寧膠囊質量標準報道較多[2-5]，含量測定的報道多集中于丹參的有效成分丹參素、原兒茶醛、丹酚酸B等[6-10]。該藥中三七、人參須為貴細藥材，均含皂苷成分，但有關皂苷含量測定方面的研究較少[11-12]。為有效地控制心可寧膠囊的質量，本研究中建立了測定心可寧膠囊中三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1及人參皂苷Re含量的高效液相色譜法，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2030C3D型高效液相色譜儀（包括二極管陣列檢測器、LC-Solution色譜工作站）、AUW220D型電子分析天平（日本島津公司）；KQ220B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品三七皂苷R1（批號為110704-201424，純度94.04%），人參皂苷 Rb1（批號為 2014424，純度 93.70%），人參皂苷 Re（批號為110754-201324，純度92.70%），人參皂苷 Rg1（批號為 110703-201530，純度 91.70% ），均購自中國食品藥品檢定研究院；心可寧膠囊（貴州飛云嶺藥業股份有限公司，批號分別為160901，160902，160903，160904，160905，160906，規格為每粒 0.4 g）；甲醇及乙腈為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（見表 1）；檢測波長：203 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；進樣量：20 μL。在此條件下，三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、人參皂苷Re及人參皂苷Rb1的色譜峰與其他雜質成分的分離度大于1.5，陰性對照品溶液對混合對照品溶液出峰無干擾。色譜圖見圖1。

表1 流動相梯度洗脫程序

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

混合對照品溶液：取各對照品適量，經五氧化二磷減壓干燥過夜，取適量，精密稱定，用70%甲醇制成每1 mL 含三七皂苷 R10.104 mg、人參皂苷 Rb11.006 mg、人參皂苷 Rg10.901 mg、人參皂苷 Re 0.252 mg 的混合對照品溶液。

供試品溶液：取樣品內容物，研細，精密稱定，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質量，超聲（功率250 W，頻率33 kHz）處理30 min，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：照現行質量標準中規定的處方工藝[1]，制備不含三七和人參須藥材的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備，即得。

2.3 方法學考察

線性關系考察：分別精密量取混合對照品溶液1，2，3，4，5 mL，分別置 5 mL 容量瓶中，加 70% 甲醇稀釋至刻度搖勻，得混合對照品系列溶液。按2.1項下色譜條件進樣分析，以待測成分的進樣量（X，mg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程及線性范圍。結果見表2。

表2 回歸方程、相關系數及線性范圍（n=5）

精密度試驗：取 2.2項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續進樣測定6次。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、三七皂苷Re峰面積的RSD分別為 0.56% ，0.87% ，0.68% ，0.72% （n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：室溫下取新制備的同一供試品（批號為 160901）溶液，分別于 0，2，4，6，8，10，24 h 時按 2.1項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的RSD均小于1%（n=7），表明室溫下供試品溶液放置24 h內穩定。

重復性試驗：取同一批樣品（批號為160901），按2.2項下方法制備供試品溶液，平行制備6份，按2.1項下色譜條件進樣，測定峰面積。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re峰面積的RSD分別 1.32% ，1.17% ，0.98%，1.22% （n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取同一批已知含量（含三七皂苷R11.72 mg／g，人參皂苷 Rb16.24 mg／g，人參皂苷 Rg17.18 mg ／g、人參皂苷 Re 1.94 mg／g）的樣品 9 份，每份約0.5 g，精密稱定，每3份為1組，分別加入一定量低、中、高濃度的對照品溶液，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率。結果見表3。

2.4 樣品含量測定

分別取6批樣品內容物約1 g，精密稱定，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量。結果見表4。

3 討論

提取方法選擇：曾比較了藥典中加熱回流提取、超聲提取等方法的提取效果，考察了不同提取時間及不同體積分數甲醇溶液對樣品測定結果的影響。結果表明，選用70%甲醇，超聲提?。üβ?250 W，頻率 33 kHz）30 min，可充分提取樣品中的皂苷成分，簡便，且提取率較高。

色譜條件選擇：本研究中采用梯度洗脫法分離皂苷成分，100 min內完成分離，4種皂苷成分分離效果良好，符合含量測定要求。本研究中通過二極管陣列檢測器考察所測物質紫外吸收度，結果在203 nm波長處有較大吸收，故選擇203 nm作為檢測波長。流動相比較了乙腈-水（梯度洗脫）和乙腈-0.05%磷酸溶液（20∶89，V∶V）系統，結果以乙腈-水為流動相梯度洗脫時各色譜峰均實現基線分離，能達到定量要求。

表3 加樣回收試驗結果（n=9）

表4 樣品含量測定結果（mg／粒，n=6）

心可寧膠囊在醫院臨床使用多年，對治療冠心病、心絞痛、心肌缺血、血栓癥、改善心電圖缺血效果極佳，比同類中藥制劑療效更突出、作用更持久。對此，該制劑以丹參為君藥，以三七、人參須等為佐藥，后兩者的有效成分主要為皂苷類成分，如三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re等，藥理活性明顯，其在神經系統有治療神經退行性疾病、改善記憶功能、保護腦組織等作用，用于心血管系統有抗心律失常、抗心肌肥厚、抗心肌缺血、抗心肌細胞凋亡等作用，在抗腫瘤方面具有誘導細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、調控信號通路、調節免疫功能等作用。故有必要控制該制劑的質量。本研究中用高效液相色譜法對心可寧膠囊中三七的有效成分三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re進行含量測定，方法簡便，結果可靠，可為進一步修訂心可寧膠囊的質量標準提供試驗依據。