不同產(chǎn)地姜黃藥材高效液相色譜指紋圖譜與化學(xué)模式識(shí)別研究*

黃衛(wèi)娟，韋卓純，姜 松，林 繪，楊麗玲

（暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬東莞醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 東莞 523900）

姜黃為姜科姜黃屬多年生草本植物，具有破血行氣、通經(jīng)止痛的功效，臨床用于治療胸痹心痛、痛經(jīng)經(jīng)閉、跌撲腫痛等[1]。姜黃主要成分是姜黃素類化合物，包括姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素等成分，具有抗癌[2-4]、抗炎[5]、抗氧化[6]、抗動(dòng)脈粥樣硬化[7-8]和保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)[9-11]等多種藥理活性，已被廣泛用于食品添加劑（無毒天然色素[12]）、化妝品（抗氧化、抗衰老）和醫(yī)藥（抗癌、抗抑郁[13-15]）等領(lǐng)域。姜黃和片姜黃均為姜科植物，前者源于姜黃干燥根莖，性溫，祛瘀力強(qiáng)，常用于治療寒凝氣滯血瘀之證；后者源于溫郁金干燥根莖，性寒，行氣力強(qiáng)，以治療血熱瘀滯之證效佳[16]。但因兩者名稱相似，來源相近，藥典收載的功能主治相同[1]，臨床使用中時(shí)常混淆，加之市場(chǎng)上流通的姜黃藥材品種混亂，質(zhì)量差異較大，直接影響姜黃的藥效。中藥指紋圖譜能全面反映中藥的質(zhì)量與臨床療效，常被用于控制中藥的質(zhì)量及區(qū)分易混淆的中藥材[17]。而聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA）常被用于色譜指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理[17]，進(jìn)而比較各藥材樣品的質(zhì)量差異。本研究中基于高效液相色譜（HPLC）技術(shù)，應(yīng)用化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)中的HCA和PCA技術(shù)研究市售姜黃藥材的質(zhì)量差異，為姜黃藥材的質(zhì)量控制提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

C-15C型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；BT25S型電子分析天平（德國 Sartorius公司）；BY-320C型低速醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；KQ-300型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

姜黃素對(duì)照品（批號(hào)為DST170111-014，純度≥99%），去甲氧基姜黃素對(duì)照品（批號(hào)為DST160920-30，純度≥98%），雙去甲氧基姜黃素對(duì)照品（批號(hào)為DST160920-21，純度≥98%），均購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；無水乙醇（分析純，廣州市中南化學(xué)試劑有限公司）；水為超純水。10批姜黃藥材（具體信息見表1）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu ODS-C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 -0.2% 甲酸溶液，梯度洗脫（見表 2）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL ／min；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

混合對(duì)照品溶液：稱取姜黃素、去甲氧基姜黃素、雙去甲氧基姜黃素各2.5 mg，精密稱定，分別置25 mL具塞錐形瓶中，加甲醇溶解并定容，得質(zhì)量濃度均為100 μg／mL 的單一對(duì)照品溶液；分別精密量取 2.5 mL，置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取藥材樣品適量，粉碎，過5號(hào)篩，稱取0.2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%乙醇20 mL，超聲提取（功率300 W，頻率40 kHz）20 min，冷卻，搖勻，5 000 r／min 離心 10 min，取上清液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

空白對(duì)照溶液：以流動(dòng)相作為空白對(duì)照溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：依法制備供試品（批號(hào)為20160801）溶液，按擬訂色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定，以姜黃素峰（5號(hào)峰）為參照峰，分別測(cè)得其中11個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，并計(jì)算RSD。結(jié)果11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.03%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.00%（n=6），表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：依法制備供試品（批號(hào)為20160801）溶液，按擬訂色譜條件，室溫下分別于 0，2，6，8，12，24，48 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，以姜黃素（5號(hào)峰）為參照峰，分別測(cè)得其中11個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，并計(jì)算RSD。結(jié)果11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于 0.10% （n=7），相對(duì)峰面積的RSD均小于2.64%（n=7），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：稱取同一姜黃藥材樣品（批號(hào)為20160801）6份，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，以姜黃素峰（5號(hào)峰）為參照峰，分別測(cè)得其中11個(gè)色譜峰的相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，并計(jì)算RSD。結(jié)果11個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.20% （n=6），相對(duì)峰面積的RSD均小于 2.00% （n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立與分析

共有模式的建立及共有峰確定：取10批藥材樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。通過“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012 A版）”軟件生成對(duì)照指紋圖譜色譜圖，并對(duì)10批姜黃樣品的色譜指紋峰進(jìn)行匹配并疊加（見圖2），得11個(gè)共有峰（見圖3）。可見，10批藥材樣品的指紋圖譜無明顯差異，均可用于共有峰的確定。

相似度評(píng)價(jià)：采用“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）”對(duì)藥材樣品指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果對(duì)照指紋圖譜的相似度均不小于0.919，見表3，表明不同批次藥材間相似度良好。

聚類分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)圖3中11個(gè)共有峰的相對(duì)峰面積進(jìn)行系統(tǒng)聚類，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以歐氏距離為區(qū)間進(jìn)行聚類分析，生成聚類樹狀圖（見圖4），10批藥材樣品大致可分為3類，S2，S3，S6，S8，S1，S9，S4，S7 為第一類；S5 為第二類；S10為第三類，可見，S5，S10與其余8批次藥材樣品比較有明顯差異。

圖2 10批藥材樣品的HPLC疊加指紋圖譜

圖3 10批藥材樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜

表3 10批藥材樣品的相似度評(píng)價(jià)

圖4 聚類分析樹狀圖

主成分分析：采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，以10批藥材樣品中11個(gè)共有峰面積原始值為變量，計(jì)算主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率及主成分得分。由主成分特征值和累積貢獻(xiàn)率（表4）、碎石圖（圖5）得知，前4個(gè)特征值的累積貢獻(xiàn)率達(dá)92.902%，說明前4個(gè)因子在反映不同來源姜黃與11個(gè)共有成分的相互關(guān)系中起主導(dǎo)作用，能用于評(píng)價(jià)姜黃藥材的品質(zhì)。其中，主成分1主要反映了 3，4，5，8，9號(hào)色譜峰的信息，主成分 2主要反映了1，2，10，11號(hào)色譜峰的信息，主成分3主要反映了7號(hào)色譜峰的信息，主成分4主要反映了6號(hào)色譜峰的信息（見表5）。結(jié)果表明，通過PCA分析降維處理后所提取的4個(gè)主成分能代表姜黃指紋圖譜中11個(gè)共有峰的主要信息。以主成分的變量得到的載荷圖（圖6）結(jié)果與初始因子載荷矩陣表相同，距離原點(diǎn)較遠(yuǎn)的幾個(gè)點(diǎn)就是主成分1中權(quán)重較大的成分，表明其在決定不同批次樣品質(zhì)量差異上起重要作用。

表4 主成分特征值和累積貢獻(xiàn)率

圖5 碎石圖

3 討論

預(yù)試驗(yàn)中比較了水、無水乙醇、40%乙醇、75%乙醇、甲醇、30%甲醇、60%甲醇7種提取溶劑，加熱回流、超聲 2 種提取方法，10，20，30，60 min 4 種提取時(shí)間及10，20，40，50 mL 4種提取溶劑體積等制備方法，結(jié)果以20 mL 75%乙醇超聲提取20 min時(shí)所得提取率最佳。

比較了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸溶液、乙腈-0.2%甲酸溶液5種流動(dòng)相及13個(gè)梯度洗脫條件，結(jié)果以乙腈-0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相時(shí)，梯度洗脫獲得色譜峰多且分離度好。考察了254 nm和265 nm 2個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果顯示，在254 nm波長(zhǎng)處各色譜峰峰形好且峰面積較大，故選定為檢測(cè)波長(zhǎng)。比較了30，35，40℃ 3種柱溫，結(jié)果柱溫為35℃時(shí)獲得的各色譜峰峰面積、拖尾因子、分離度均較好。分別以 0.8，1.0 mL ／min 為流速進(jìn)行比較，結(jié)果1.0 mL／min流速下峰面積較大且出峰時(shí)間合適。

表5 初始因子載荷矩陣

圖6 10批藥材樣品的載荷圖

10批藥材樣品與對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.919～0.999，說明不同產(chǎn)地姜黃藥材間相似度較好。這也提示了單一的相似度評(píng)價(jià)難以全面地反映不同產(chǎn)地姜黃藥材的差異性。為了更全面、整體地評(píng)價(jià)各個(gè)產(chǎn)地姜黃的質(zhì)量差異，采用化學(xué)模式識(shí)別方法中的HCA和PCA進(jìn)一步分析，建立藥材樣品的HCA和PCA分類模型，發(fā)現(xiàn)批次S5和S10與其余8批次比較有明顯差異，并確定了4個(gè)主成分，篩選出5個(gè)差異性成分，指認(rèn)出了其中3個(gè)成分，分別為姜黃素、去甲氧基姜黃素和雙去甲氧基姜黃素。

綜上所述，本研究中建立的姜黃HPLC指紋圖譜較理想，結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別技術(shù)可用于姜黃藥材的質(zhì)量控制，為中藥材的識(shí)別和化學(xué)成分的比較提供了參考，亦為課題組后續(xù)關(guān)于單味中藥姜黃對(duì)斑馬魚內(nèi)毒素性炎癥損傷保護(hù)作用及作用機(jī)制的研究提供了試驗(yàn)用藥材、試驗(yàn)用制劑質(zhì)量控制的依據(jù)。