青果多糖組分對人宮頸癌Hela細胞增殖的抑制作用研究*

劉 梅，王 穎，王耀登，劉 洪，王 琴

（重慶市中醫(yī)院，重慶 400021）

癌癥是嚴重危害人類健康的惡性疾病，根據(jù)2017年國家癌癥中心發(fā)布的中國最新癌癥報告，中國每年新發(fā)癌癥病例429萬，即全國每天約1萬人確診癌癥，每1分鐘約7人確診患癌。癌癥已成為嚴重影響國民身體健康和社會發(fā)展的重要因素，為我國的醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大壓力[1]。目前，臨床預防和治療惡性腫瘤主要以化學治療為主，順鉑和5-氟尿嘧啶等是常用藥物，但因毒副作用較大而限制了使用，故開發(fā)研制新型有效、副作用低的抗腫瘤藥物成為科研工作者關注的重點。多糖是一類由多羥基醛或多羥基酮通過糖苷鍵連接而成的天然高分子聚合物，具有多種天然活性，如調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗腫瘤[2-3]等作用。青果Canarii Fructus為橄欖科植物橄欖Canarium album（Lour.）Raeusch.的干燥成熟果實，味甘、酸，性平，具有清熱解毒、利咽、生津的功效。現(xiàn)代藥理學研究表明，青果具有抗炎[4]、鎮(zhèn)痛[5]、抗氧化[6]及抑制腫瘤細胞增殖[7]的作用。本研究中提取分離青果中的多糖類成分，并對其部位多糖和蛋白多糖類成分抑制人宮頸癌Hela細胞的增殖作用進行研究。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試藥與儀器

細胞：人宮頸癌Hela細胞株[美國菌種保藏中心（ATCC），批號為 bc1043]。

藥材：青果（四川欣康中藥飲片有限公司，批號為170401），經(jīng)重慶市中醫(yī)院藥劑科藥檢室王琴副主任中藥師鑒定為正品。

儀器：Synergy HT型全自動酶標儀（美國Biotek公司）；BSA124S型電子分析天平（德國 Sartorius公司）；TDA-8002型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏設備有限公司）；DHG-9053A型電熱鼓風干燥箱（上海申賢恒溫設備廠）。

試藥：DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、1%青-鏈霉素、0.25%胰蛋白酶（美國Gibco公司）；BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo公司）；四氮唑鹽（MTT）試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術有限公司）；DEAE-瓊脂糖凝膠FF（中國北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司）；3 500 Da透析袋（中國上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇、氯化鈉（重慶川東化工集團有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 青果粗多糖的制備及含量測定

提取流程：取青果飲片，粉碎，加8倍量無水乙醇，加熱回流提取4 h，濾過；藥渣置電熱鼓風干燥箱中，40℃烘干，加8倍量水煎煮3次，合并水煎液，濾過，去殘渣；減壓濃縮至濃稠液，加4倍量無水乙醇使醇體積分數(shù)達80%，靜置過夜，去上清液，收集沉淀，揮干，依次用無水乙醇、丙酮、乙醚洗滌，揮干，加水溶解，冷凍干燥，即得青果粗多糖。

DEAE-瓊脂糖凝膠FF預處理：以0.2 mol／L氫氧化鈉溶液清洗DEAE-瓊脂糖凝膠FF至無色，以蒸餾水洗至中性，再以0.1 mol／L鹽酸溶液清洗至無色，以蒸餾水洗至中性，蒸餾水配置成勻漿，減壓脫氣1 h，直至漿液無任何氣泡，裝柱（35 mm×30 cm），蒸餾水平衡過夜。

青果粗多糖各部位分離：稱取約5 g青果粗多糖，溶于20 mL蒸餾水，4 000×g離心5 min，取上清液，玻璃棒引導，沿色譜柱壁緩緩加樣，依次以蒸餾水、0.5mol／L 氯化鈉溶液、1.0mol／L 氯化鈉溶液、2.0mol／L氯化鈉溶液洗脫，采用苯酚-硫酸法檢測洗脫液含糖部分，收集，透析袋用自來水流水透析24 h，減壓濃縮，冷凍干燥，得青果粗多糖各部位，即 CFW，CF1，CF2，CF3。

總多糖含量測定：稱取D-葡萄糖對照品20 mg，精密稱定，置250 mL容量瓶中，加去離子水定容，分別量取 0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8 mL，置 2 mL容量瓶中，加去離子水定容，加6%苯酚1.0mL及濃硫酸5.0 mL，搖勻，靜置20 min；于 490 nm波長處測定吸光度，以去離子水為空白對照，得標準曲線。吸取待測溶液適量，按上述步驟操作，根據(jù)標準曲線計算總多糖含量。

總蛋白含量測定：以BCA蛋白定量法測定，配制工作液，并配制1 g／L待測溶液。根據(jù)微孔板方案（樣品與工作液的比例為1∶8），取3組樣品，按標準曲線法操作，取平均值，根據(jù)標準曲線計算總蛋白含量。

1.2.2 細胞試驗

細胞培養(yǎng)：置Hela細胞于含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃及5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代。

藥液制備：分別稱取 CFW，CF1，CF2，CF3 約 2 mg，精密稱定，置滅菌EP管中，加入含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，使質(zhì)量濃度為1 000 μg／mL，振搖混勻，4 000×g離心 5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm無菌濾頭濾過除菌，倍比稀釋，得質(zhì)量濃度均為 62.5，125，250，500 μg／mL 的 CFW，CF1，CF2，CF3溶液。

細胞增殖抑制試驗：采用MTT法，選取對數(shù)生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶進行消化，重懸，調(diào)整細胞密度約為 5×104個／mL，以每孔 100 μL接種于 96孔板中；于37℃及5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后，棄去上清液，加入 200 μL不同質(zhì)量濃度的CFW，CF1，CF2，CF3溶液，每組設置 3個復孔；同時以不含多糖的細胞培養(yǎng)液為空白對照；于37℃及5%CO2細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48 h后，每孔加 20 μL MTT溶液（25 mg MTT溶于5 mL MTT溶液中），細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 4 h，棄去培養(yǎng)液，每孔加 150 μL Formazan溶解液，搖床上振搖15min，于37℃下、570nm波長處，以酶標儀測定每孔吸光度（A）。抑制率（%）=（1-A試驗／A對照）×100%。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 青果多糖的總糖和總蛋白含量

青果粗多糖得率為7.11%，性狀為淡黃色粉末。CFW，CF1，CF2，CF3 得率分別為 36.8% ，25.5% ，14.1% ，13.7% ，總回收率為 90.1% ，性狀均為白色粉末狀。結果見表1。

表1 青果粗多糖總糖和總蛋白含量（±s，% ，n=3）

表1 青果粗多糖總糖和總蛋白含量（±s，% ，n=3）

成分 總糖 總蛋白C F W C F 1 C F 2 C F 3 8 0.4 3 ±1.9 9 7 6.3 8 ±1.0 3 7 0.9 0 ±0.5 3 7 2.5 4 ±1.1 2 1 4.5 9 ±0.1 9 3.3 7 ±0.2 3 1.5 6 ±0.1 3 0.8 7 ±0.0 9

2.2 Hela細胞增殖抑制效果

與空白對照比較，62.5，125，250，500，1 000 μg ／mL CFW，500 μg／mL 和 1 000 μg／mL CF1 及 1 000 μg／mL CF2和 CF3的A顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），表明以上質(zhì)量濃度組分對Hela細胞增殖有抑制作用。結果見表2。

表2 CFW，CF1，CF2，CF3對Hela細胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

表2 CFW，CF1，CF2，CF3對Hela細胞增殖的抑制作用（±s，n=3）

注：與空白對照比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01。A570指 570 nm 波長處的吸光度。

質(zhì)量濃度（μg／mL）空白對照組別CFW CF1 CF2 CF3 A570抑制率（%）0 17.1 ± 5.2 30.5 ±4.4 43.5 ±3.9 50.8 ± 2.3 57.6 ± 3.1 A570 A570抑制率（%）0 0.1 ± 7.8 1.5 ±5.0 8.0 ±5.3 12.1 ± 5.7 13.4 ± 6.5抑制率（%）0 4.6 ± 3.2 8.2 ±4.8 11.3 ±5.1 16.9 ± 4.5 22.4 ± 3.9 A570 0 CFW 62.5 125 250 500 1 000 0.959 ± 0.075 0.795 ± 0.050△0.667 ± 0.042△0.542 ± 0.038△0.471 ± 0.022△0.406 ± 0.030△0.959 ± 0.075 0.915 ± 0.030 0.880 ±0.046 0.850 ±0.049 0.797 ± 0.044△0.744 ± 0.038△0.959 ± 0.075 0.945 ± 0.048 0.882 ±0.051 0.843 ±0.055 0.830 ± 0.062 0.785 ± 0.057*0.959 ± 0.075 0.943 ± 0.039 0.912 ± 0.026 0.860 ± 0.042 0.850 ± 0.046 0.775 ± 0.039△抑制率（%）0 1.7 ± 4.0 4.9 ±2.8 10.3 ±4.4 11.4 ± 4.8 19.2 ±4.1

3 討論

本試驗中利用乙醇除脂、水提、醇沉的方法從青果中提取得到粗多糖和粗多糖復合物成分，進一步利用DEAE-瓊脂糖凝膠FF離子交換色譜對提取得到的粗多糖和粗多糖復合物成分進行部位分離，得到CFW，CF1，CF2，CF3 4個部位，通過總多糖和總蛋白含量測定，得 CFW 為含有（80.43±1.99）%總多糖和（14.59±0.19）%總蛋白的蛋白多糖類，而 CF1，CF2，CF3 為含有極少量蛋白的多糖類成分。

MTT法是一種檢測細胞增殖和存活的方法，原理為活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細胞中的甲瓚，以酶標儀測定A，可間接反映活細胞數(shù)量。在一定細胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結晶形成的量與細胞數(shù)呈正相關。

本試驗中采用MTT法檢測CFW，CF1，CF2，CF3這4個組分抑制人宮頸癌Hela細胞增殖的作用，結果顯示，CFW 在 62.5，125，250，500，1 000 μg ／mL 質(zhì)量濃度下均可顯著抑制Hela細胞增殖，1 000 μg／mL質(zhì)量濃度下的抑制率達（57.6 ±3.1）%，CF1，CF2，CF3 在高質(zhì)量濃度條件下也可顯著抑制Hela細胞的增殖，但抑制活性較弱。

近年來，具有抗腫瘤活性的多糖類和糖蛋白類成分不斷被發(fā)現(xiàn)，如絞股藍多糖GPP2可顯著抑制人肝癌HepG2細胞和人宮頸癌Hela細胞的增殖[8]，蛤蚧糖蛋白GSPP可抑制人肝癌SMMC-7721細胞的增殖[9]，鮑魚菇糖蛋白LB-1b可顯著抑制人肝癌HepG2細胞和人乳腺癌MCF7細胞的增殖[10]。本試驗在體外試驗中發(fā)現(xiàn)，青果中CFW組分具有顯著抑制人宮頸癌Hela細胞的增殖作用，為青果開發(fā)為抗腫瘤藥物提供了前期的理論基礎。