銀杏葉標準湯質量評價研究及高效液相色譜指紋圖譜的建立*

陳 萍 ，薛佩蕓 ，梁馨月 ，楊 錦 ，郭 冬

（1.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712046； 2.陜西省中醫藥研究院，陜西 西安 710003；3.兵器工業衛生研究所，陜西 西安 710065）

銀杏葉為銀杏科植物銀杏Ginkgo bilobaL.的干燥葉，味甘、苦、澀，性平，歸心、肺經，具有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘、化濁調脂的功效，臨床多用于瘀血阻絡、胸痹心痛、中風偏癱、肺虛咳喘、高脂血癥的治療[1]。主要有效成分為黃酮類和萜類內酯化合物，二者均具有改善心血管系統、調血脂、抗氧化、抗衰老等作用[2-5]。中藥飲片的標準湯是通過標準化工藝規程制備而成的單味中藥飲片水煎液[6-8]，是標準化中藥不同用藥形式的參照物，亦為連接傳統中藥飲片和現代中藥制劑的“橋梁”，為實現中藥制劑產品的一致性提供了有效途徑。本研究中采用高效液相色譜（HPLC）法測定銀杏葉標準湯的待測成分含量，建立HPLC指紋圖譜對銀杏葉標準湯的化學指紋標定，并開展其質量評價。現報道如下。

1 藥材、儀器與試藥

1.1 藥材

試驗所用銀杏葉飲片（來源見表1）經陜西省中醫藥研究院楊智峰教授鑒定為正品，經檢查，以雜質、水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物及總黃酮苷類成分、萜類內酯成分均合格的15批（編號S1～S15）飲片進行下一步試驗。

1.2 儀器

1260型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；U-2910型紫外-可見分光光度計（日本Hitachi公司）；BT25S型及BS210S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；CP2102型電子分析天平（奧豪斯儀器＜上海＞有限公司）；DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；201V1型電熱恒溫干燥箱（上海實驗儀器廠有限公司）。

1.3 試藥

槲皮素對照品（批號為100081-201610，含量為99.1%），山柰素對照品（批號為 110861-201209，含量為93.2%），異鼠李素對照品（批號為301819Y53，含量為99.6%），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

表1 銀杏葉飲片來源

2 方法與結果

2.1 槲皮素、山柰素及異鼠李素含量測定

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Welchrom C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（50 ∶50，V／V）；流速：1.0mL／min；檢測波長：360 nm；柱溫：30℃；進樣量：10μL。

2.1.2 溶液制備

對照品溶液：稱取槲皮素對照品、山柰素對照品、異鼠李素對照品各適量，精密稱定，加甲醇制成每1mL含槲皮素 30.14 μg、山柰素 30.36 μg、異鼠李素 19.376 μg的混合對照品溶液。

供試品溶液：按國家衛生部和國家中醫藥管理局《醫療機構中藥煎藥室管理規范》[9]，取飲片樣品150 g，加8倍量水，浸泡30 min，沸騰后加熱回流30 min，趁熱濾過；藥渣加8倍量水，加熱回流3 min，趁熱濾過，合并濾液，以水定容至2 500 mL，制得供試品原液。精密量取20 mL，水浴蒸至近干，加甲醇-25% 鹽酸溶液（4∶1，V／V）20 mL，水浴回流提取 30 min，定量轉入 25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻，即得。

陰性對照溶液：精密量取水20mL，按供試品溶液制備方法中自“水浴蒸至近干”起同法制備，制得陰性對照溶液。

2.1.3 方法學考察

圖1 高效液相色譜圖

專屬性考察與系統適用性試驗：取上述3種溶液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結果，陰性對照溶液在與對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好；槲皮素、山柰素及異鼠李素的保留時間分別為 11.738，20.146，22.529 min，分離度均大于1.5，理論板數均大于6 000。

線性關系考察：分別精密量取混合對照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，1.5，2.0，3.0 mL，置 5 mL 容量瓶中，加流動相定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液，精密量取10 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分進樣量（X，μg）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸。回歸方程與線性范圍見表2。

表2 回歸方程與線性范圍（n=6）

精密度試驗：取混合對照品溶液適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果槲皮素、山柰素及異鼠李素峰面積的RSD分別為2.70%，2.62%，2.64%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩定性試驗：取供試品（批號為160502）溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，16，20，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果槲皮素、山柰素及異鼠李素峰面積的RSD分別為1.07%，1.36%，1.12%（n=8），表明供試品溶液在室溫放置24h內基本穩定。

重復性試驗：精密稱取供試品原液（批號為160502）適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算樣品含量。結果槲皮素、山柰素及異鼠李素含量平均值分別為0.033 1%，0.009 4%，0.003 4% ，RSD分別為 1.07%，0.97%，1.50%（n=6），表明方法重復性良好。

加樣回收試驗：取已知含量的供試品（批號為160502）原液2 mL，共9份，分別加入低、中、高質量濃度的混合對照品溶液，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表3。

表3 加樣回收試驗結果（n=9）

2.1.4 含量測定與出膏率、總黃酮醇苷轉移率計算

含量測定：取15批供試品原液各適量，分別依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量，結果見表4。

表4 指標成分含量及出膏率、轉移率計算結果

出膏率計算：精密量取15批供試品原液各100 mL，置質量恒定的蒸發皿中，水浴蒸干，于烘箱105℃干燥至恒定質量，計算出膏率（Y），Y（% ）=m1／100×V／m2×100%（m1為干浸膏質量，V為樣品溶液總體積，m2為飲片質量），結果見表4。15批標準湯出膏率為11.63% ～ 16.21%，平均（13.89 ±1.42）%。

總黃酮醇苷轉移率計算：分別按如下公式計算總黃酮醇苷轉移率，轉移率（%）=供試品原液中總黃酮醇苷含量／藥材中總黃酮醇苷含量×100%，結果見表4。15批標準湯總黃酮醇苷轉移率為41.95% ～69.92%，平均（0.26±0.06）%。

2.2 高效液相色譜指紋圖譜建立

2.2.1 方法學考察

精密度試驗：取供試品原液（批號為160503）適量，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，以山柰素為參考峰，計算共有峰相對峰面積和相對保留時間。結果的RSD均小于3%（n=6），表明方法精密度良好。

穩定性試驗：取供試品溶液（批號為160503）適量，分別于室溫下放置 0，2，4，8，12，24 h 時按擬訂色譜條件進樣測定，以山柰素為參考峰，計算共有峰相對峰面積和相對保留時間。結果的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

重復性試驗：取供試品原液（批號為160503）適量，依法制備供試品溶液，再按擬訂色譜條件進樣測定，以山柰素為參考峰，計算共有峰相對峰面積和相對保留時間。結果的RSD均小于3%（n=6），表明方法重復性良好。

2.2.2 指紋圖譜建立

取15批供試品原液各適量，按擬訂色譜條件進樣測定，圖譜數據導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）中。參照圖譜設為S1，對照圖譜生成方法設為平均數，時間窗寬度設為0.10，多點校正，自動匹配，生成對照，分別計算相似度。結果見圖2和表5。結果15批銀杏葉標準湯與對照指紋圖譜相似度均大于0.95，表明一致性良好。

3 討論

3.1 指標成分篩選

標準湯中槲皮素、山柰素、異鼠李素提取率高、轉移率穩定，三者總量（總黃酮苷）能表征提取物的均一性，故采用此三者為質量評價的定量指標成分[9-11]。

3.2 量值傳遞與質量評價

本研究中主要從標準湯制備、標準湯兩方面進行過程評價，所得15批銀杏葉標準湯的平均出膏率為（13.89 ±1.42）% ，總 黃 酮 苷 平 均 含 量 為 （55.93±13.79）%；通過建立標準湯的總黃酮苷（槲皮素、山柰素、異鼠李素）含量測定方法，同時建立標準湯特征指紋圖譜測定方法，從指紋準確定性和指標成分定量方面實現了對銀杏葉標準湯的整體質量評價。

圖2 15批銀杏葉標準湯特征指紋圖譜重疊圖

表5 15批銀杏葉標準湯相似度評價結果

3.3 參數范圍確定

按本研究中所建立的15批銀杏葉標準湯各參數均值的75% ～125%計，其參數范圍如下：出膏率10.41% ～17.38% ，總黃酮苷轉移率 41.95% ～69.91% ，各項實測值均位于標準湯參數范圍內，表明銀杏葉標準湯質量均一性好。