對羥基苯甲醛對模型大鼠腦缺血再灌注損傷修復作用研究*

楊 媛，代 蓉，張冰琳，賈媛媛，馬琛婧

（云南中醫(yī)藥大學中藥學院，云南 昆明 650500）

腦缺血再灌注損傷（CIRI）是導致缺血性腦卒中進一步惡化的主要原因[1]，其病理過程涉及復雜的時間級聯(lián)反應，早期以神經損傷為主，后期以神經修復為主[2]。機體在CIRI的后期觸發(fā)啟動內源性修復機制，通過多種途徑進行神經的自我修復，其中神經營養(yǎng)因子的釋放，對缺血灶周圍神經細胞的恢復、神經突起新生、新突觸形成及神經功能重塑等的促進作用明顯[3]。但這種神經自我修復能力是有限的，因此通過藥物增強機體的內源性神經修復，對于CIRI的恢復及預后具有重要意義[4]。前期研究發(fā)現(xiàn)，天麻主要活性成分之一對羥基苯甲醛（PHBA）對模型大鼠的CIRI有改善作用，其保護機制與抗神經細胞凋亡有關，抗凋亡保護受損神經元是促進神經修復的重要環(huán)節(jié)，提示PHBA具有促CIRI神經修復的作用[5]。本研究中從調控內源性神經營養(yǎng)因子的角度出發(fā)，探討PHBA促大腦中動脈栓塞再灌注（MACO／R）大鼠神經修復的作用及其機制。現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：清潔級SD大鼠，雄性，體質量250～300 g，購自四川省醫(yī)學科學院實驗動物研究所，動物生產許可證號為SCXK（川）2016-16。標準條件飼養(yǎng)，自由進食、飲水，適宜溫度、濕度，人工黑暗和光照交替。

儀器：165-8001型垂直電泳系統(tǒng)、1654100型半干轉膜裝置，均購自Bio-Rad公司；BioSpectrum AC Chemi HR410型凝膠成像分析系統(tǒng)（美國UVP公司）；PrimoR型高速臺式冷凍離心機（美國ThermoFisher公司）；Ti-S型熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

試藥：PHBA（北京百靈威科技有限公司，批號為L760N29）；血管內皮生長因子A（VEGF-A）多克隆抗體（批號為EP1176Y）、腦源性神經營養(yǎng)因子（BDNF）單克隆抗體（批號為 EPR1292）、神經元特異核蛋白（NeuN）多克隆抗體（批號為 EPR12763），均購自英國Abcam公司；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體（美國 Proteintech Group，Inc.，批號為 10494-1-AP）；吐溫-80（天津市風船化學試劑科技有限公司，批號為Q ／HG3020-99）。

1.2 方法

1.2.1 建模、分組與給藥

選取體質量大于280 g的大鼠30只，腹腔注射10%水合氯醛（300 mg／kg）麻醉，以線栓法建立大鼠中動脈缺血再灌注模型[6-7]。建模成功標準：激光散斑監(jiān)測大鼠腦血流量降至基礎值的43%～53%；激光多普勒監(jiān)測大鼠腦血流量降低至基礎值的10%～20%；Longa 5分法檢測神經學評分為1～3分。取建模成功大鼠20只，分為模型組（等體積含吐溫-80的蒸餾水）和PHBA 組（20 mg／kg），各 10只。另取正常大鼠 10只，進行阻塞中動脈線栓法操作，作為假手術組（等體積含吐溫-80的蒸餾水），各組灌胃給予相應藥物，每天1次，連續(xù)14 d，灌胃體積為每100 g體質量1 mL。以PHBA 200 mg，加吐溫-80助溶，完全溶解后用蒸餾水定容至100 mL，作為受試藥品溶液。

1.2.2 考察指標

神經病學評分：給藥7 d及14 d后，參照Longa 5分法[8]行大鼠神經病學評分。0分，無明顯神經功能障礙；1分，提尾懸空不能伸展左側前爪、有運動障礙；2分，行動不協(xié)調，行走時向左側傾斜、劃圈；3分，行走困難，并向左側傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識水平下降。

NeuN陽性表達水平檢測：采用免疫熒光法。給藥7 d及14 d后，各組取4只大鼠，快速斷頭取腦，4%對多聚甲醛固定2 h，20%、30%蔗糖梯度脫水后包埋、切片（15 μm），復溫 40 min，用 0.01 mol／L 磷酸鹽緩沖液（PBS，含 0.1%Triton）漂洗 3 次，50% 山羊血清室溫孵育 2 h；在 0.01 mol／L PBS 中加入一抗 NeuN（1 ∶100，V／V），4 ℃ 孵育過夜；取出后用 0.01 mol／L PBS（含0.1%Triton）漂洗 3 次，在 0.01 mol／L 磷酸鹽緩沖液中加入二抗室溫孵育 1 h；取出后用 0.01 mol／L PBS（含0.1%Triton）漂洗3次，擦干水分，避光封片，熒光顯微鏡拍攝。以鏡下綠色與藍色熒光重合表達處，作為陽性表達。

VEGF-A和BDNF蛋白表達水平檢測：采用Western blot法。給藥7 d及14 d后，各組取6只大鼠，快速斷頭取腦，于-80℃凍存。取凍存大鼠腦組織，加細胞裂解液，超聲勻漿 10 min，13 000 r／min 離心 5 min，取上清液，以二喹啉甲酸（BCA）法進行蛋白定量。95℃水浴5min，取上清液制備50 μg蛋白樣品。電泳后轉PVDF膜，加一抗、BDNF（1 ∶1 000，V／V）、VEGF-A（1 ∶200，V／V）、GAPDH（1 ∶1 000，V／V），室溫孵育 2 h，回收一抗；TBST洗膜3次，分別加入二抗，37℃孵育1 h，TBST洗膜，加入ECL化學發(fā)光試劑，將PVDF膜放入暗盒中，壓上X膠片，取出膠片后顯影、定影、清洗。然后，通過Image J軟件將條帶灰度值數(shù)字化，目的條帶與內參條帶灰度比值為各目的蛋白相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

結果見表1、表2、圖1和圖2。

表1 各組大鼠神經病學評分及NeuN陽性表達水平比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠神經病學評分及NeuN陽性表達水平比較（±s，n=10）

注：與假手術組比較，#P ＜0.05，##P ＜ 0.01；與模型組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。表 2 同。

組別 神經病學評分（分） N e u N陽性表達水平7 d 1 4 d 7 d 1 4 d假手術組模型組P H B A組0 3.0 0 0 0±0.8 1 6 5##2.2 0 0 0±0.6 3 2 5*0 3.2 0 0 0±0.7 8 8 8##2.2 0 0 0±0.6 3 2 5**0.2 0 5 9 0±0.0 3 1 5 7 0.0 6 9 8 8±0.0 5 9 2 5##0.1 8 1 8 0±0.0 6 5 7 5**0.2 0 1 4 0±0.0 3 2 4 4 0.0 2 5 5 6±0.0 5 8 3 4##0.1 7 2 6 0±0.0 7 6 6 8**

表2 各組大鼠腦內VEGF-A和BDNF蛋白表達水平比較（±s，n=6）

表2 各組大鼠腦內VEGF-A和BDNF蛋白表達水平比較（±s，n=6）

V E G F-A B D N F組別7 d 1 4 d 7 d 1 4 d假手術組模型組P H B A組0.5 5 1 3 ±0.2 2 3 8 1.0 9 6 0 ±0.3 4 4 1#1.6 1 3 0 ±0.5 6 4 1*0.4 2 5 3 ±0.1 1 4 1 1.2 3 8 0 ±0.5 8 7 8#1.8 9 0 0 ±0.6 2 4 6 0.2 0 3 5 ±0.0 0 8 9 0.1 6 3 3 ±0.0 1 5 3##1.3 3 9 0 ±0.5 0 5 4**0.1 9 5 9 ±0.0 0 8 4 0.1 7 8 3 ±0.0 1 3 5#1.7 7 8 0 ±0.7 9 0 9**

3 討論

CIRI發(fā)生后，大腦皮質缺血或局灶性病變可引起損傷區(qū)微環(huán)境變化，導致神經細胞及膠質細胞結構改變，觸發(fā)內源性神經修復，但這種由疾病引發(fā)的自身適應性改變由于缺乏促進軸突再生和引導其正確延伸發(fā)展的微環(huán)境，很難再生形成功能性突觸聯(lián)系，最終會導致神經功能完全缺失，這種內源性修復對受損神經功能的修復作用是有限的[9]。神經修復治療就是對CIRI這一過程的發(fā)生、發(fā)展及影響因素進行研究，通過藥物或細胞治療刺激和促進機體分泌神經營養(yǎng)及保護因子等，為神經功能修復創(chuàng)造一個良好的微環(huán)境，促進內源性神經修復，并最大限度修復患者受損神經功能[10]。因此，積極尋找可調控多種生長因子和使用安全、方便的促神經修復藥物仍是目前CIRI研究的重點[11]。

圖1 大鼠大腦皮層NeuN表達水平（×200）

圖2 大鼠腦內VEGF-A及BDNF蛋白表達水平

線栓法[12]可機械性阻斷大腦中動脈的血供來建立大腦中動脈缺血模型，在缺血后拔出線栓，恢復血流實現(xiàn)再灌注損傷，于是本試驗中采用腦缺血再灌注模型，以模擬CIRI的損傷過程，對模型大鼠連續(xù)給予PHBA 14 d，觀察受試藥對模型大鼠的促神經修復作用及其機制。

神經病學評分可通過模型大鼠體征異常變化判斷神經功能缺損的程度。NeuN是神經組織中成熟神經細胞的特異性表達蛋白，參與神經系統(tǒng)的發(fā)育、分化和功能維持，其表達數(shù)量變化可反映神經元的受損程度[13]。本研究中以神經病學評分和大腦皮層NeuN陽性表達為指標，以評價PHBA對神經功能的影響。結果表明，PHBA給予7 d及14 d后，可降低模型大鼠的神經病學評分，升高模型大鼠大腦皮層NeuN陽性表達水平，提示其可促進神經功能的修復。

CIRI的發(fā)生會導致VEGF-A表達水平的升高，VEGF-A可直接促進腦缺血后海馬區(qū)的神經再生，對腦缺血后內源性神經修復發(fā)揮著重要作用。

BDNF是神經生長因子家族成員之一，在正常情況下能促進中樞神經系統(tǒng)發(fā)育過程中神經細胞的表達、分化及突觸可塑性的調節(jié)；在CIRI發(fā)生過程中，其表達水平的升高能抑制神經細胞的凋亡，將有利于受損神經細胞的修復[14-16]。VEGF-A是由內皮細胞分泌的神經生長因子，在正常情況下能促進內皮細胞的增殖、遷移、分化，參與血管的生長[17]。在CIRI發(fā)生過程中，其表達水平的升高能為受損神經元提供營養(yǎng)，以促進神經修復[18-19]。本研究中以BDNF和VEGF-A表達水平為指標，以評價PHBA促神經修復的作用機制，結果表明，給予PHBA 7 d及14 d后，可升高模型大鼠腦內BDNF和VEGF-A的表達水平

綜上所述，PHBA可促進腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經的修復，其作用機制與促進內皮細胞釋放神經營養(yǎng)因子VEGF-A和BDNF有關。