基于CdSe/ZnS量子點熒光生物傳感器構建與應用*

唐志英， 孫澤坤， 馮泳林， 邵麗萍, 白忠臣,

(1.貴州大學 醫學院，貴州 貴陽 550025； 2.貴州大學 貴州省光電子技術與應用重點實驗室，貴州 貴陽 550025)

0 引 言

熒光共振能量轉移(F?rster resonance energy transfer,FRET)是一種由于分子間長距離的偶極子發生偶極耦合，從而將一個受到激發的熒光分子(施體)的能量轉移給另一個熒光分子(受體)，使其熒光增強的物理過程[1～3]。由于其操作簡便，實用性強，現在已經廣泛地應用于司法鑒定、細胞標記、農草藥等科學研究領域[4,5]。

過去使用FRET方法構建的能量體系，能量供受體的光學穩定性差，體系的熒光強度弱，生物相容性和對環境的敏感變化欠佳(如鑭系元素、有機熒光染料)，且由于其毒性較大，生物體內存在自體熒光和雜射光干擾，導致實驗達不到預期效果，最終熒光傳感器的發展與應用受到限制[6～9]。近年來，量子點(quantum dots,QDs)作為一種發光半導體，具有發射帶窄，尺寸可協調，光化學穩定性強及單波長同時可激發多個粒子的特點被廣泛應用，這是傳統的材料在性能上無可比擬的。

隨著現代研究技術的發展，越來越多的科學研究人員對生物傳感器的靈敏度和可重復使用性展開了更加深入的研究，致力于發展實用性能強，應用范圍廣的生物傳感器[10,11]。目前，Wang J等人構建了一個基于FRET平臺的橫向流動測試條，用于檢測腫瘤細胞[12]，實驗設計的FRET生物傳感器可以作為一種快速、有效的腫瘤細胞檢測方法。

本文致力于構建一種基于熒光共振能量轉移機理的量子點生物傳感器，CdSe/ZnS量子點作為能量供體，熒光染料Cy3作為能量受體，通過構建FRET體系使得熒光染料熒光增強，從而彌補其在生物實驗中的缺陷。實現了基于FRET機理構建的近紅外區域能量轉移體系的生物傳感器的構建與應用，可以作為癌細胞形成初期的檢測方法之一[13,14]，為前列腺癌細胞形成初期的靈敏度診斷及特異性較差等問題提供了一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

實驗試劑：水溶性CdSe/ZnS(-NH2)量子點購于北京北達聚邦科技有限公司;熒光染料Cy3(C31H37KN2O8S2),購于南京拜恩特斯生物科技有限公司。實驗所用溶劑不作特殊說明均用蒸餾水。RPMI—1640培養基購自CORNING(美國，紐約)公司，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購于四季青公司，胰蛋白酶(Trypsin)購于HyClone(USA)公司；青鏈霉素購自Solarbio(中國，北京)公司，MTT試劑購自Solarbio(中國，北京)公司，二甲基亞砜(DMSO)購自Solarbio(中國，北京)公司。

實驗儀器：高精度電子天平,磁力攪拌器加熱臺,超聲清洗器,恒溫水浴箱,移液槍,透射電子顯微鏡,光致熒光光譜儀(蔚海光學儀器上海有限公司),UV—6100S型紫外—可見光吸收光譜儀(上海精密儀器儀表有限公司),傅里葉光譜儀(德國布魯克光譜儀器公司),熒光倒置顯微鏡(DMi8,Leica,德國)，多功能酶標儀SYNERGY—H4(美國 Biotek)，細胞恒溫培養箱FormaTMⅡ3110系列水套CO2培養箱(Thermo Scientific公司產品)，Allegra X—15R 臺式冷凍離心機(美國BECAKMAN COULTER公司)。

1.2 實驗方法

FRET體系的構建:將CdSe/ZnS量子點溶液和Cy3熒光染料按照摩爾比例為1∶0,1∶0.28,1∶0.4,1∶0.52,1∶0.76,1∶0.88,1∶1.2和1∶1.4混合加入反應樣品瓶中,在常溫、常壓條件下攪拌5 min,對混合溶液進行熒光測定。

熒光光譜測定:在室溫條件下,依次取0.1 ml量子點溶液與染料構建FRET體系溶液,反之依次取0.1 mL染料溶液與量子點溶液構建FRET體系溶液,以365 nm為激發波長,掃描精度為0.79 nm的Ocean Optics QED65000型熒光光譜儀進行測試,記錄200～1 100 nm波長范圍內的發射光譜變化。

傅里葉紅外光譜測定:常溫下將CdSe/ZnS量子點溶液,Cy3熒光染料和FRET體系溶液滴在云母片上,80 ℃下真空烘干24 h備用。分別將3種待測樣品置于傅里葉紅外顯微鏡光譜儀下進行測量,獲得3種樣品數據。

前列腺癌細胞熒光成像:將實驗中需要使用的前列腺癌細胞分種在6孔培養板中。實驗前需要將前列腺癌細胞培養24 h，細胞傳代密度達到60 %～70 %即可。量取配制好的FRET體系溶液10 μL對前列腺癌細胞進行染色(pH=7.3)，搖勻后在37 ℃，5 %CO2環境中培養5 min，移去培養液，用PBS清洗3遍，在熒光倒置顯微鏡下觀察其細胞形態并進行熒光成像研究。

2 結果與討論

2.1 CdSe/ZnS量子點與Cy3熒光染料FRET體系構建

經過紫外吸收及熒光光譜測試,CdSe/ZnS量子點的熒光發射光譜與Cy3染料的吸收光譜有較大的重疊面積,在圖1標記出的陰影部分即為重疊部分,而CdSe/ZnS量子點的發射光譜的最大發射峰與染料的發射峰相距達到34 nm,可以有效避免供體與受體之間的熒光發射干擾。所以,CdSe/ZnS量子點與Cy3熒光染料符合構建FRET體系的基本條件,其中,供體CdSe/ZnS量子點與受體Cy3染料可成功地構建FRET體系。

圖1 CdSe/ZnS量子點與Cy3熒光染料的吸收和發射光譜對比

通過查閱文獻發現,供體CdSe/ZnS量子點表面游離的氨基(-NH2)可以與受體染料Cy3表面游離的羧基(-COOH)以化學鍵相結合的方式進行連接,可以使供受體之間的距離縮短。

圖2中,CdSe/ZnS量子點在3 280 cm-1(-NH2)處存在明顯的振動峰,Cy3染料在1 615 cm-1(-COOH)處存在振動峰。供體CdSe/ZnS量子點與受體Cy3染料的鍵合方式是通過CdSe/ZnS量子點表面的-NH2和Cy3染料表面的-COOH發生脫水縮合形成了肽鍵(-CO-NH-)。曲線1表示FRET熒光共振能量轉移體系,該體系在1 570 cm-1(-CO-NH-)處的振動峰存在,證明了兩種樣品已經成功的鍵合,該峰在CdSe/ZnS量子點與Cy3染料單獨的紅外光譜中均不存在。并且在Cy3染料的傅里葉光譜中的1 615 cm-1處的振動峰在構建的FRET體系中明顯減弱,證明該FRET體系已經成功發生鍵合。

圖2 CdSe/ZnS量子點、Cy3熒光染料、FRET體系的FTIR光譜

2.2 CdSe/ZnS量子點與Cy3熒光染料濃度變化影響

為了探究CdSe/ZnS量子點與Cy3熒光染料所構建的FRET體系的最適宜熒光轉移強度,本文對不同濃度的CdSe/ZnS量子點與Cy3所構建的FRET體系進行了熒光測試。在熒光強度的計算上,通過查閱文獻使用Haugland和Styrer給出的公式E=1-ID-A/ID,其中ID-A,ID分別為有受體和無受體時供體的熒光強度。最后,經過測量供體熒光強度計算出量子點與染料構建的FRET體系的效率E。

可以從圖3(a)看到,固定Cy3染料濃度,當量子點濃度逐漸增加時(0.1～0.5 μmol/L),Cy3染料的熒光強度發生了明顯的變化,并且逐漸增強,實驗證明量子點與熒光染料之間發生了明顯的熒光共振能量轉移。計算得到圖3(b),從圖中可以看出CdSe/ZnS量子點濃度與Cy3染料成正向線性關系,當CdSe/ZnS量子點濃度增加時,構建的FRET體系的熒光共振能量轉移效率逐漸增強。發生這種現象的原因是當供體分子數量增加時,單個受體周圍的平均分子數目增多,導致體系的熒光共振能量轉移效率最終增大。

圖3 改變CdSe/ZnS量子點濃度時的FRET體系

反向實驗發現,當量子點濃度不變時,改變Cy3染料濃度,獲得的FRET體系的熒光光譜圖如圖4(a)所示。從圖中可以看出,當Cy3染料濃度增加時,量子點熒光強度逐漸減小,達到峰值即最大熒光轉移效率后量子點熒光強度又開始增強。經過計算得到了圖4(b)的Cy3染料改變后的熒光共振能量轉移效率。由圖4(b)可以看出,當受體濃度增加時,FRET體系的能量轉移效率逐漸增大,在QDs∶Cy3的比例為1∶1.2時,熒光共振能量轉移效率為最大值,產生這種現象的原因是由于隨著Cy3染料濃度的增強,量子點周圍所圍繞的受體染料分子達到最大值,之后當量子點濃度再增加時,FRET體系的熒光共振能量轉移效率減小。

圖4 改變Cy3濃度時的FRET體系

2.3 pH值對FRET體系的影響

本文針對CdSe/ZnS量子點與Cy3熒光染料所構建的FRET體系的pH值改變進行了實驗。如圖5所示,將CdSe/ZnS量子點溶解于pH值為3，7，11，13的去離子水中,Cy3染料溶于pH值為2，7，11，13的去離子水中進行熒光光譜測試。由圖5(a)可以看出,CdSe/ZnS量子點溶液隨著溶液pH值的增大,量子點的熒光強度發生了明顯的改變,對于表面含有-NH2的量子點溶液,強酸性條件下熒光強度最弱,這是由于溶液中含有大量的H+使得量子點表面氨基難以解離。反之當溶液偏堿性時,溶液中含有豐富的OH-,從而促進了量子點上-NH2的H+逃脫,但過高的pH值會使量子點的熒光降低。而對表面含有-COOH的Cy3染料而言,隨著pH值的逐漸增加,染料的熒光強度明顯減小,這是由于在強酸性條件下溶液中含有大量的H+使得染料表面羧基難以解離,而隨著溶液中OH-離子濃度增加,染料表面的羧基解離,熒光強度減弱。

圖5 CdSe/ZnS量子點與Cy3在不同pH值溶液中的熒光光譜

查閱文獻發現,癌細胞在形成初期會存在pH值的細微改變,因此，本文在對構建熒光共振能量體系的供體和受體進行了pH值響應實驗,發現通過調整FRET(CdSe/ZnS—Cy3)體系的pH值,可以對實驗構建的體系產生微弱的熒光強度改變。從而,本文中提出一種對癌細胞形成初期系統微環境變化的檢測方式,通過監控該FRET體系的pH值變化,最終實現對癌癥的初期檢測。

為了驗證該熒光共振能量轉移體系在pH值細微改變(pH=5.93～8.36)后熒光強度的變化,調整溶液pH值后進行熒光測試,得到圖6所示結果。

圖6 FRET體系在不同pH值溶液中的熒光光譜

從圖6中可以看出隨著溶液pH值的降低,FRET體系的熒光強度逐漸減弱,且熒光區分強度大,這表明該體系可以用來作為檢測癌細胞形成初期pH值改變的熒光探針。

2.4 FRET體系對癌細胞檢測應用

對于本實驗構建的FRET體系，在生物應用方面首先使用MTT比色分析法驗證該體系對細胞毒性。

從圖7實驗結果可以看出，24 h后隨著FERT(CdSe/ZnS—Cy3)體系濃度增加，細胞活性降低，但還是有80 %以上的細胞存活，證明該體系具有良好的生物兼容性，可在生物細胞實驗中應用。

圖7 FRET體系細胞毒性測試

由于量子點具有特殊的熒光信號使得本文構建的FRET體系不僅可以對癌細胞形成初期的pH值進行檢測，還可以對癌細胞進行熒光標記,如圖8所示。通過設計熒光標記實驗可以看出，其生長狀態良好，細胞形態正常且為不規則多邊形的前列腺癌細胞在經過FRET體系的染色后，沒有出現細胞形態的變化，在不同熒光照射下，顯示出了清晰的細胞輪廓，說明該生物傳感器對細胞的毒性較低，可以作為熒光探針對癌細胞進行熒光標記，在實驗中使用。

圖8 FRET體系對前列腺癌細胞的熒光標記

3 結 論

研究表明：本文設計的CdSe/ZnS量子點和熒光染料Cy3的FRET系統具有較高的能量轉移效率。當CdSe/ZnS量子點與Cy3染料的比例為1∶1.2時，熒光轉移效率達到83.68 %。在溶液的pH=5.93～8.36范圍內體系熒光變化敏感，還可用于檢測前列腺癌細胞微環境變化，該熒光共振能量轉移系統的建立對前列腺癌細胞識別和前列腺生物傳感器的應用提供了一個新的思路。