樂爾脈膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達的影響Δ

池寧娟，劉明義，馮娟，石小鵬，楊志福，文愛東（空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科，西安710032）

腦缺血再灌注（Cerebral ischemia/reperfusion，CI/R）后會引起一系列病理生理損傷，包括氧自由基損傷、鈣離子內流、興奮性氨基酸大量釋放等[1-2]。目前，已認識到神經保護劑可作為治療CI/R損傷的方式，但大量神經保護劑在臨床試驗中的轉化失敗和不良反應，使得抗CI/R損傷藥物的研究成為世界性難題[3-5]。中醫藥因其多靶點、多途徑等優勢在治療CI/R損傷方面發揮著重要作用，成為近年來治療缺血性腦卒中的研究熱點[6-7]。

樂爾脈膠囊為我院研制的中藥復方制劑，由當歸、黃芪、延胡索等五味藥組成，具有益氣、活血、化瘀等功效，臨床上用于治療缺血性腦血管疾病和腦中風，能夠有效治療腦梗死兼瘀血癥、明顯改善患者的神經功能。本課題組以往的研究表明，樂爾脈膠囊可作用于CI/R損傷后的炎性反應和大腦皮層細胞凋亡環節[8-10]，從而發揮抗CI/R損傷的作用，但樂爾脈膠囊對CI/R誘導的氧化應激性腦損傷的作用還不清楚。核因子E2相關因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）是調控機體抗氧化應激反應的核轉錄因子，氧化應激條件下可激活抗氧化酶包括血紅素加氧酶1（HO-1）、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶等[11]。故本研究擬采用大鼠大腦中動脈閉塞/再灌注（MCAO/R）模型，觀察樂爾脈膠囊對腦缺血再灌注損傷大鼠大腦皮層組織中抗氧化應激反應因子HO-1、銅鋅超氧化物歧化酶（Copper-zinc superoxide dismutase，SOD1）、錳超氧化物歧化酶（Mn-superoxide dismutase，SOD2）和Nrf2蛋白的影響，闡明其治療腦缺血的作用機制，為其臨床用藥提供依據。

1 材料

1.1 儀器

BSA224S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）有限公司] ；RM2235輪轉式石蠟切片機（德國Leica公司）；680酶標儀（美國Bio-Rad公司）；SH01D臺式高速離心機（上海知信實驗儀器技術有限公司）；Aquaplore 3S超純水機（美國Aquapro公司）。

1.2 藥品與試劑

樂爾脈膠囊（由空軍軍醫大學第一附屬醫院藥劑科提供，批號：160402，規格：0.35 g）；腦心通膠囊（西安步長制藥有限公司，批號：160547，規格：0.4 g）；2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，上海埃彼化學試劑有限公司，批號：20160218）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒（北京雷根生物技術有限公司，批號：DH0006）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒、RIPA裂解液（杭州弗德生物科技有限公司，批號：FD2001、FD008）；HO-1、SOD1、SOD2、Nrf2兔抗人多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：SC-164941、SC-160347、SC-160648、SC-160851）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（內參）、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液（武漢博士德生物工程有限公司，批號：BM0627、BA1054、AR1112）；其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

1.3 動物

健康SD大鼠65只，♂，體質量（270±10）g，由空軍軍醫大學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（軍）2016-0007。所有大鼠均在環境溫度（25±1）℃、相對濕度45%～65%、光照時間12 h的清潔環境中飼養1周后進行實驗，飼養期間大鼠自由進食標準飼料和飲水。本實驗方案通過空軍軍醫大學第一附屬醫院動物實驗倫理審查。

2 方法

2.1 分組、造模和給藥

將65只大鼠隨機分為5組，分別為假手術組、模型組、陽性對照組和樂爾脈膠囊高、低劑量組，每組13只。大鼠禁食過夜、自由飲水。次日，采用線栓法[12]復制MCAO/R大鼠模型。待大鼠清醒后回籠飼養，術后24 h開始灌胃給藥，其中假手術組和模型組大鼠灌胃蒸餾水10 mL/kg，陽性對照組大鼠灌胃腦心通膠囊3.40 g/kg[13]，樂爾脈膠囊高、低劑量組大鼠分別灌胃樂爾脈膠囊0.37、0.18 g/kg（參考前期研究[8-9]及長期毒性實驗結果確定給藥劑量，分別為人臨床用量的16.1、7.8倍），各組大鼠均每天灌胃1次，連續給藥7 d。

2.2 大鼠腦缺血面積測定

末次給藥2 h后，麻醉大鼠，每組取6只，斷頭取腦，置于預冷的生理鹽水中，冰浴10 min后，將其以冠狀面切成2.5 mm的切片，共取5～6片置于5 mL含有1.5%TTC的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液中，避光37℃孵育40 min，期間輕搖2次，待正常腦組織為玫瑰紅色、缺血區呈蒼白色時，棄去染液，將組織置于4%多聚甲醛中固定過夜，然后用數碼相機拍照，用MiasPro圖像分析軟件測定缺血面積，并計算缺血面積比[缺血面積比（%）＝缺血面積/全腦面積×100%] 。

2.3 大鼠皮層組織病理學觀察

取“2.2”項下的大鼠大腦皮層組織，在4℃條件下置于4%多聚甲醛溶液中固定，常規脫鈣、脫水、透明、浸蠟、包埋制成石蠟標本，行4～6 μm切片，HE染色后，在顯微鏡下觀察其病理學變化。

2.4 大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達水平測定

每組取剩余7只大鼠，麻醉，斷頭取腦，取損傷側皮層組織，置于液氮中過夜，移至－80℃冰箱中凍存，備用。臨用時，取出凍存的大腦皮層組織，采用全蛋白提取液提取組織蛋白，以BCA法進行蛋白定量，調整上樣量為25 μg蛋白/泳道，經10%SDS-PAGE電泳，濕法轉膜、封閉，分別與HO-1、SOD1、SOD2、Nrf2兔抗人多克隆抗體和β-actin抗體（稀釋比例均為1∶300）雜交，4℃孵育過夜，次日以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗（稀釋比例為1∶5 000），37 ℃孵育50～70 min，然后以TBST緩沖液洗膜4次，每次5 min；化學發光顯影，壓片，最后采用Gel-Pro Analyzer軟件對蛋白條帶進行分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白的相對表達水平。

2.5 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。結果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 樂爾脈膠囊對MCAO/R模型大鼠腦缺血面積的影響結果

TTC染色結果顯示，假手術組大鼠腦組織無缺血情況；模型組大鼠腦組織損傷嚴重，腦缺血面積比為18.77%；與模型組比較，陽性對照組和樂爾脈膠囊高、低劑量組大鼠腦缺血面積比均顯著減小（P＜0.05），分別減小到12.19%、13.25%和11.35%。各組大鼠腦組織TTC染色圖見圖1，腦缺血面積比測定結果見圖2。

圖1 各組大鼠腦組織TTC染色圖Fig 1 TTC staining of cerebral tissue in rats in each group

注：與假手術組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05Note：vs.sham operation group，＊P＜0.05；vs.model group，#P＜0.05

3.2 大鼠皮層組織病理學觀察結果

假手術組大鼠大腦皮層組織結構完整，神經細胞嗜色均勻，椎體細胞突起明顯，未見炎性細胞浸潤。模型組大鼠大腦皮層損傷側間質重度水腫，細胞間隙明顯增大，炎性細胞浸潤明顯增加，小膠質細胞腫脹，神經纖維斷裂，核深染，胞漿嗜酸性增多。與模型組比較，陽性對照組大鼠大腦皮層損傷側壞死區縮小，間質水腫明顯降低，有少量炎性細胞浸潤和小膠質細胞增生；樂爾脈膠囊高劑量組和陽性對照組大鼠大腦皮層損傷側范圍相對縮小，間質水腫減輕，炎性細胞浸潤減少，小膠質細胞增生減弱；樂爾脈膠囊低劑量組大鼠大腦皮層損傷側組織損傷程度較模型組有明顯改善，損傷區中心炎性細胞浸潤明顯減少，壞死空白區少見，形態完整，未見壞死區呈結節狀分布。各組大鼠大腦皮層組織病理學觀察顯微鏡圖見圖3。

圖3 各組大鼠大腦皮層組織病理學觀察顯微鏡圖（HE染色，×40）Fig 3 Histopathological micrograph of cerebral cortex in rats of each group（HE staining，×40）

3.3 樂爾脈膠囊對大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達水平的影響結果

與假手術組比較，模型組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），SOD2、Nrf2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，陽性對照組大鼠大腦皮層組織中SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05），HO-1蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；而樂爾脈膠囊高、低劑量組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達均顯著升高（P＜0.05）。各組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2的蛋白電泳圖見圖4，測定結果見圖5。

4 討論

圖4 各組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2的蛋白電泳圖Fig 4 Electrophoretic diagrams for protein expression of HO-1，SOD1，SOD2 and Nrf2 in cerebral cortex of rats in each group

圖5 各組大鼠大腦皮層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達水平測定結果Fig 5 Protein expression of HO-1，SOD1，SOD2 and Nrf2 in cerebral cortex of rats in each group

在引起CI/R損傷的諸多因素中，備受關注的是氧化應激損傷。氧化應激損傷可導致脂質過氧化、DNA損傷等，最終導致神經元損傷和凋亡，因此抑制氧化應激能夠有效減輕CI/R損傷[13]。生物在進化過程中不斷完善自身復雜的防御功能，其中Nrf2、HO-1和SOD是體內抗氧化應激和維持氧化還原平衡的幾個重要因子[14-15]。Nrf2為調控機體抗氧化應激反應的核轉錄因子，參與激活多種與細胞保護和解毒相關基因的表達，在氧化應激狀態下，Nrf2被激活，使得Nrf2從細胞質轉移到細胞核，和下游基因HO-1抗氧化反應片段結合，在氧化應激細胞反應中起重要作用[16-17]。SOD為生物體內重要的抗氧化酶，其按照結合金屬離子種類不同可分為SOD1、SOD2、鐵超氧化物歧化酶（Fe-superoxide dismutase）等，而SOD1和SOD2都能參與清除氧自由基，從而保護細胞免受氧化性損傷[18]。

腦心通膠囊具有益氣活血、化瘀通絡的功效，臨床上用于氣虛血滯、脈絡瘀阻所致中風的治療。有研究表明，腦心通膠囊能夠在一定程度上改善患者神經功能缺損癥狀、提高腦梗死患者治療效果、降低腦梗死疾病復發率[19]，故本研究根據臨床療效和安全性，綜合考慮選則腦心通膠囊為本研究的陽性對照藥。本研究結果顯示，模型組大鼠腦缺血面積較假手術組顯著增加，大腦皮層損傷側間質水腫明顯，炎性細胞浸潤增加；灌胃高、低劑量樂爾脈膠囊后可明顯減小模型大鼠腦缺血面積，縮小其大腦皮層損傷側范圍，減輕其間質水腫和炎性細胞浸潤，明顯改善大腦皮質組織形態，并且低劑量樂爾脈膠囊的效果優于高劑量樂爾脈膠囊和陽性對照藥。筆者分析其可能原因，可能是由于樂爾脈膠囊為中藥復方制劑，其成分復雜，灌胃高劑量時對大鼠的副作用明顯增加，或有效成分入腦減少。Western blot檢測結果顯示，模型組大鼠大腦皮層組織中HO-1和SOD1蛋白表達水平升高，SOD2、Nrf2蛋白表達水平降低；灌胃高、低劑量樂爾脈膠囊后大鼠大腦皮質層組織中HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白表達水平均顯著升高。本研究結果顯示，MCAO/R后能引起抗氧化因子HO-1和SOD1蛋白表達增加，這是因為術后7 d隨著腦氧化應激反應的增強，自由基生成增加，機體抗氧化應激系統也被動員，以對抗氧化應激增強所致的組織損傷。有研究也證實，在CI/R損傷后，HO-1存在過表達，并可上調凋亡抑制基因的表達，而SOD1的過表達可減緩急性CI/R損傷[13，17]。

綜上所述，本研究在以往研究基礎上進一步證實了樂爾脈膠囊可通過抗氧化應激反應發揮抗CI/R損傷的作用，其作用機制可能是通過調控HO-1、SOD1、SOD2和Nrf2蛋白的表達，但更多的機制有待進一步考察。