HPLC法測(cè)定人胸腔積液中左氧氟沙星的濃度及其藥動(dòng)學(xué)研究Δ

蘇碧雅，張黎明，楊梅珍，邵發(fā)林（天水市第一人民醫(yī)院藥劑科，甘肅天水741000）

喹諾酮類抗菌藥物是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，屬濃度依賴型抗菌藥，第三代喹諾酮類抗菌藥物對(duì)革蘭氏陽性、陰性菌均有較明顯的抗菌后效應(yīng)[1]。左氧氟沙星是臨床常用的治療肺部感染的抗菌藥物，在耐藥結(jié)核桿菌感染的治療中也被廣泛使用，其給藥方案多參照血液中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)制訂。有關(guān)左氧氟沙星血藥濃度的高效液相色譜法（HPLC）已有很多報(bào)道[2-4]，但血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)與胸腔積液不同，故左氧氟沙星血藥濃度監(jiān)測(cè)的HPLC法并不能直接用于左氧氟沙星胸腔積液樣品的檢測(cè)，且血漿中左氧氟沙星的藥動(dòng)學(xué)研究也并不能準(zhǔn)確反映肺組織中左氧氟沙星的分布情況，因此對(duì)感染部位的藥物濃度進(jìn)行測(cè)定，具有更大的臨床意義。但目前國內(nèi)尚無文獻(xiàn)報(bào)道人用左氧氟沙星后，左氧氟沙星在肺部的藥動(dòng)學(xué)特征。胸腔積液（Pleural effusion）是以胸膜腔內(nèi)病理性液體積聚為特征的一種常見的臨床癥候，對(duì)該類患者胸腔積液中左氧氟沙星的藥動(dòng)學(xué)進(jìn)行研究，再根據(jù)檢測(cè)結(jié)果結(jié)合藥動(dòng)學(xué)/藥效學(xué)理論以及病原菌最低抑菌濃度（MIC）綜合分析，能指導(dǎo)臨床醫(yī)師更合理、準(zhǔn)確地使用左氧氟沙星，保證用藥有效性和安全性。故本文采用HPLC外標(biāo)法，用甲醇沉淀胸腔積液中蛋白質(zhì)后，測(cè)定左氧氟沙星的含量。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260液相系統(tǒng)，包括二極管陣列檢測(cè)器（美國Agilent公司）；TD4B臺(tái)式低速自動(dòng)平衡離心機(jī)（長沙平凡儀器儀表有限公司）；XW-80A旋渦混合器（上海青浦滬西儀器廠）；UPD-?-10T小型純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；MD200-2氮吹儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；Eppendorf移液器（德國Eppendorf公司）；AUY220分析天平（日本島津公司）。

1.2 藥品與試劑

左氧氟沙星對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：130455，純度：97.1%）；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 胸腔積液來源

本文選擇的研究對(duì)象為我院呼吸內(nèi)科收治的6名感染性胸腔積液患者，所采集的胸腔積液為滲出液，研究患者入選標(biāo)準(zhǔn)為（1）肺部感染患者；（2）經(jīng)胸部CT檢查，胸腔積液量達(dá)到250 mL以上，可以行胸腔穿刺置管引流術(shù)者；（3）靜脈滴注左氧氟沙星注射液進(jìn)行抗感染治療，給藥劑量為0.4 g qd的患者；（4）配合度良好，能保證按時(shí)取樣的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)為（1）單純性結(jié)核性胸腔積液患者；（2）單純性腫瘤性胸腔積液患者；（3）其他原因不明的胸腔積液患者。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液[含0.3%三乙胺，70 ∶30（V/V）] ；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長：294 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取左氧氟沙星對(duì)照品10 mg，置于25 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得400 μg/mL的左氧氟沙星甲醇貯備液，置于4℃冰箱保存。臨用前將該貯備液用甲醇逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列對(duì)照品溶液即可。

2.3 胸腔積液樣品的前處理方法

取胸腔積液樣品500 μL，置于離心管中，加甲醇2 000 μL，渦旋混合3 min，4 000 r/min離心15 min后，取上清液于另一離心管中，在相同條件下二次離心，取上清液，用氮吹儀揮干甲醇后，加入500 μL甲醇復(fù)溶，渦旋混合均勻后用0.25 μm的微孔濾膜濾過，置于自動(dòng)進(jìn)樣分析小瓶中，吸取20 μL進(jìn)樣分析。

2.4 專屬性考察

取對(duì)照品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。另取6名感染性胸腔積液患者使用左氧氟沙星前抽取的胸腔積液的混合液（簡(jiǎn)稱空白胸腔積液）、空白胸腔積液+對(duì)照品、胸腔積液樣品（給藥后1 h），按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜。

2.5 線性關(guān)系考察

取質(zhì)量濃度為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的對(duì)照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮吹儀揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，渦旋15 s混合均勻，配成含左氧氟沙星質(zhì)量濃度分別為0.625、1.25、2.5、5、10、20 μg/mL的系列質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行做3份，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，重復(fù)3次，取平均值。以左氧氟沙星峰面積（A）為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（c）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析。

2.6 檢測(cè)限與定量下限考察

將質(zhì)量濃度為0.625 μg/mL的對(duì)照品溶液，逐級(jí)稀釋后，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比為3∶1，確定左氧氟沙星的檢測(cè)限；以標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低點(diǎn)為左氧氟沙星的定量下限。

2.7 相對(duì)回收率試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為1.25、10、15 μg/mL的對(duì)照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮?dú)鈨x揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，制成質(zhì)量濃度分別為1.25、10、15 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行做3份，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積A1。取空白胸腔積液適量，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，加入對(duì)照品溶液制備成相應(yīng)質(zhì)量濃度的溶液，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積A2。以A1/A2計(jì)算相對(duì)回收率。

2.8 精密度與準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為1.25、10、15 μg/mL的對(duì)照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮?dú)鈨x揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，制成質(zhì)量濃度分別為1.25、10、15 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行做5份，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，同一天內(nèi)測(cè)定3次考察日內(nèi)精密度；每天測(cè)定1次，連續(xù)測(cè)定3 d，考察日間精密度；將測(cè)得峰面積代入回歸方程計(jì)算左氧氟沙星的濃度，以實(shí)測(cè)值/加入值計(jì)算準(zhǔn)確度。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取質(zhì)量濃度為1.25、10、15 μg/mL的對(duì)照品溶液，各500 μL，分別置于離心管中，用氮?dú)鈨x揮干甲醇后，加入空白胸腔積液500 μL，制成質(zhì)量濃度分別為1.25、10、15 μg/mL的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行做15份，取3份按“2.3”項(xiàng)下方法處理后立即進(jìn)樣分析；3份室溫下放置4 h后按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析；3份按“2.3”項(xiàng)下方法處理后再置于4℃冰箱放置12 h后進(jìn)樣分析；3份于冰箱中冷凍保存4周后取出融化，再按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析；3份反復(fù)凍融3次后再按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣分析，考察穩(wěn)定性。

2.10 藥動(dòng)學(xué)考察

按“2.3”項(xiàng)下方法處理6名感染性胸腔積液患者靜脈滴注左氧氟沙星0.4 g qd后0.5、1、2、4、8、12、24 h的胸腔積液，再按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，代入回歸方程計(jì)算濃度。使用GraphPad軟件繪制胸腔積液中左氧氟沙星的藥-時(shí)曲線，將上述濃度數(shù)據(jù)代入WinNonlin 5.2軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。

3 結(jié)果

3.1 專屬性

在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，左氧氟沙星的保留時(shí)間為4.9 min左右，峰形良好，與前后鄰近峰能有效分離，胸腔積液中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)其測(cè)定無干擾，基線平穩(wěn)。色譜圖見圖1。

3.2 線性關(guān)系

得回歸方程為A＝40.71c+1.640 3（R2＝0.998 9），胸腔積液中左氧氟沙星檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為0.625～20 μg/mL。

3.3 檢測(cè)限與定量下限

胸腔積液中左氧氟沙星的檢測(cè)限為0.156 μg/mL，定量下限為0.625 μg/mL。

3.4 相對(duì)回收率

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

結(jié)果顯示，質(zhì)控樣品中左氧氟沙星的相對(duì)回收率均在80%以上，符合相關(guān)要求規(guī)定。相對(duì)回收率結(jié)果見表1。

表1 相對(duì)回收率結(jié)果（n＝3）Tab 1Results of relative recovery rate（n＝3）

3.5 精密度和準(zhǔn)確度

結(jié)果顯示，測(cè)得濃度的日內(nèi)、日間RSD均小于5%，準(zhǔn)確度在（97.76±4.85）%～（100.87±2.25）%范圍內(nèi)，均符合相關(guān)規(guī)定。精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果見表2。

表2 精密度與準(zhǔn)確度結(jié)果（n＝5）Tab 2Results of precision and accuracy（n＝5）

3.6 穩(wěn)定性

結(jié)果顯示，測(cè)定濃度的RSD均小于5%，質(zhì)控樣品的穩(wěn)定性良好。穩(wěn)定性結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性結(jié)果（n＝3）Tab 3Results of stability（n＝3）

3.7 藥動(dòng)學(xué)

胸腔積液中左氧氟沙星的藥-時(shí)曲線見圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表4。

4 討論

4.1 檢測(cè)波長的確定

2015年版《中國藥典》記錄的左氧氟沙星HPLC法中紫外檢測(cè)波長為294 nm和238 nm[5]。本文前期研究發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)波長為294 nm時(shí)胸腔積液內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)左氧氟沙星出峰干擾最小，靈敏度較高，所以本文最終選取294 nm作為左氧氟沙星的檢測(cè)波長。

圖2 胸腔積液中左氧氟沙星的藥-時(shí)曲線Fig 2 Plasma concentration-time curve of levofloxacin in pleural effusion

表4 胸腔積液中左氧氟沙星的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)（n＝6）Tab 4 Pharmacokinetic parameter of levofloxacin in pleural effusion（n＝6）

4.2 柱溫的選擇

在HPLC法檢測(cè)中，提高柱溫可以降低流動(dòng)相的黏度、增加樣品在流動(dòng)相中的溶解度、縮短樣品的保留時(shí)間，故控制柱溫可調(diào)整待測(cè)物質(zhì)出峰時(shí)間。經(jīng)過對(duì)不同柱溫的測(cè)試，比較了柱溫為25、30、35℃時(shí)左氧氟沙星的吸收峰的峰形、拖尾因子及與其他峰的分離度等，同時(shí)考慮到柱溫過高可能縮短色譜柱壽命、影響生物樣品的穩(wěn)定性，故最終柱溫定為35℃。

4.3 蛋白沉淀劑的選擇

甲醇和乙腈為HPLC檢測(cè)最常用的兩種有機(jī)流動(dòng)相，選擇甲醇和乙腈為蛋白沉淀劑可以最大程度的減少溶劑效應(yīng)的影響，故本研究選擇蛋白沉淀劑時(shí)分別試用了乙腈和甲醇。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙腈和甲醇作為蛋白沉淀劑均能滿足相關(guān)要求，但考慮到甲醇毒性較乙腈低，故選擇甲醇作為本實(shí)驗(yàn)的蛋白沉淀劑。體外藥物分析時(shí)一般采用外標(biāo)法，體內(nèi)藥物分析因提取步驟煩瑣，都采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正，但因?yàn)楸痉椒▋H使用4倍體積甲醇沉淀蛋白，無提取等煩瑣步驟，而且儀器穩(wěn)定性、方法的精密度均良好，故選擇用外標(biāo)法進(jìn)行定量測(cè)定。

4.4 方法實(shí)用性

左氧氟沙星為臨床常用的喹諾酮類抗菌藥物，抗菌譜廣，可用于治療銅綠假單胞菌引起的感染[6]、鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染[7]，也可與其他抗結(jié)核藥物聯(lián)用用于治療耐藥結(jié)核菌感染[8]。左氧氟沙星在治療肺部、膽系、泌尿系、腸道等部位感染中使用廣泛，其在肺組織中濃度高，是治療肺部感染的常用抗菌藥物，但目前對(duì)左氧氟沙星肺部的藥動(dòng)學(xué)研究多停留在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段[9]。本研究以甲醇和磷酸二氫鉀緩沖液為流動(dòng)相，以甲醇為沉淀劑，建立測(cè)定患者胸腔積液中左氧氟沙星濃度的HPLC法，樣品處理方便，出峰速度快，10 min即可完成1個(gè)樣品分析，分析成本較低，適用于臨床左氧氟沙星胸腔積液濃度測(cè)定及左氧氟沙星的肺部藥動(dòng)學(xué)研究。