HPLC-DAD法同時測定柴黃片中6種成分的含量Δ

丁長玲，崔俊鳳，石效榮，徐洋洋，成文娜，張金杰，趙麗（.濱州醫學院附屬醫院藥學部，山東濱州5660；.濱州市食品藥品檢驗檢測中心，山東濱州 5668；.濱州醫學院附屬醫院疼痛科，山東濱州5660）

柴黃片質量標準收載于2015年版《中國藥典》（一部）[1]，是由柴胡和黃芩經現代工藝加工制備而成的中藥制劑，具有清熱解表之功效，臨床上用于治療風熱感冒引起的發熱、周身不適、咽喉腫痛、頭痛目眩等病癥[2]。現行標準中只規定了黃芩中黃芩苷的含量測定，沒有規定柴胡中活性成分的含量控制，黃芩中主要活性成分黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素的含量以及柴胡中的主要活性成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d含量高低均會影響制劑的功效。為了更好地控制藥品質量，確保柴黃片的臨床療效，筆者采用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（HPLC-DAD）法同時測定柴黃片中的黃芩（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素）和柴胡（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）中6種有效成分的含量，為全面評價該藥物的質量提供一種簡便快速、準確可靠的檢驗方法，并為臨床應用該制劑提供確切的質量保障。

1 材料

1.1 儀器

Agilent Technologies 1260 HPLC儀、Agilent Technologies G1315D DADVL檢測器（美國安捷倫科技有限公司）；XSE205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-700 DV超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

柴黃片（陜西盤龍制藥集團有限公司，批號20170812、20171216、20180623，規格：0.5 g）；6種對照品黃芩苷（批號：110715-201720，純度：93.5%）、漢黃芩苷（批號：110753-200411，純度：95.5%）、黃芩素（批號：111595-201306，純度：97.6%）、漢黃芩素（批號：111514-201605，純度：96.5%）、柴胡皂苷 a（批號：110777-201510，純度：93.2%）和柴胡皂苷 d（批號：110778-201205，純度：94.6%）均來源于中國食品藥品檢定研究院；柴胡、黃芩藥材均購自安徽井泉集團中藥飲片有限公司（批號：分別為20170611、20180226），均經山東中醫藥大學中藥鑒定室周鳳琴主任中藥師檢定為正品；乙腈為色譜純、磷酸為優級純、乙醇為分析純、試驗用水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品貯備溶液 精密稱取6種對照品適量，分別置于25 mL量瓶中，加入適量的50%乙醇，振搖，溶解后定容至刻度，搖勻，即得黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的質量濃度分別為0.948 8、0.414 8、0.393 9、0.407 2、0.404 5、0.386 3 mg/mL的對照品貯備溶液。

2.1.2 混合對照品溶液 分別精密量取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d對照品貯備溶液各4.0、2.0、1.0、1.0、1.0、1.0 mL，置于10 mL量瓶中，搖勻，得混合對照品溶液，每1 mL溶液中含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d分別為379.52、82.96、39.39、40.72、40.45、38.63 μg。

2.1.3 供試品溶液 取本品10片，用手術刀片輕輕刮除包衣，精密稱定，研細；取約0.5 g，精密稱定，置于100 mL量瓶中，加入50%乙醇適量，30℃水溫超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）45 min，放冷；加50%乙醇至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液5 mL，置于50 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液即得。

2.1.4 缺柴胡陰性對照溶液 取黃芩100 g，按照柴黃片相應工藝制法制成100片，按“2.1.3”項下方法制成缺柴胡陰性對照溶液。

2.1.5 缺黃芩陰性對照溶液 取柴胡100 g，按照柴黃片相應工藝制法制成100片，按“2.1.3”項下方法制成缺黃芩的陰性對照溶液。

2.2 色譜條件及系統適用性、專屬性試驗

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-磷酸三乙胺水溶液（B，取三乙胺5 mL用水稀釋至1 000 mL，用磷酸調節pH至7.0）為流動相進行梯度洗脫（0～50 min，25%A→70%A；50～60 min，70%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm（柴胡皂苷a和柴胡皂苷d）、277 nm（黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素）；柱溫：30℃；進樣量：5 μL。精密吸取混合對照品溶液、供試品溶液（批號：20170812）和陰性對照溶液各5 μL進樣分析，結果各檢測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.90～1.10，理論板數以黃芩苷峰計均大于6 000；在供試品溶液的色譜圖上，在與對照品溶液黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d相應的位置上，均有相同保留時間的色譜峰，陰性對照溶液在對應保留時間處未見色譜峰，不干擾測定，表明系統的適用性良好及方法的專屬性良好。色譜見圖1、圖2、圖3。

圖1 混合對照品溶液高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram of mixed control solution

2.3 線性關系、檢測限、定量限考察

取混合對照品溶液1、5、10、15、20 μL，注入HPLC儀中，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，以對照品進樣量（μg）為橫坐標（x），對各成分的峰面積（縱坐標，y）進行線性回歸，計算出線性回歸方程。另將混合對照品溶液逐級稀釋，當信噪比3∶1時得檢測限，當信噪比為10∶1時得定量限，結果見表1。

2.4 精密度試驗

精密吸取混合對照品溶液，在“2.2”項色譜條件下連續進樣6次，記錄黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的色譜峰面積，計算其RSD分別為0.62%、0.71%、0.55%、0.67%、0.83%、0.79%（n＝6），表明該儀器的精密度良好。

圖2 供試品溶液高效液相色譜圖Fig 2 HPLC chromatogram of test sample

圖3 陰性溶液高效液相色譜圖Fig 3 HPLC chromatogram of negative solution

表1 6種成分的線性關系Tab 1 Linear relationship of 6 components

2.5 穩定性試驗

精密吸取同一批供試品溶液（批號：20170812）5 μL，在“2.2”項色譜條件下，在配制后0、4、8、16、32、48 h進樣測定，記錄黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的色譜峰面積，計算其RSD分別為0.51%、0.57%、0.72%、0.64%、0.85%、0.93%（n＝6），表明供試品溶液在48 h內穩定性良好。

2.6 重復性試驗

取批號為20170812的藥品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，記錄黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的峰面積，計算其含量的RSD分別為0.83%、0.80%、0.75%、0.69%、0.98%、1.02%（n＝6）。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取含量已知的柴黃片（批號：20170812）6份，分別置于100 mL量瓶中，分別精密加入0.948 8 mg/mL黃芩苷對照品溶液20.0 mL、0.414 8 mg/mL漢黃芩苷對照品溶液10.0 mL、0.393 9 mg/mL黃芩素對照品溶液5.0 mL、0.407 2 mg/mL漢黃芩素對照品溶液2.0 mL、0.404 5 mg/mL柴胡皂苷a 1.5 mL、0.386 3 mg/mL柴胡皂苷d 1.0 mL，加入50%乙醇適量，30℃水溫超聲處理（功率：500 W，頻率：40 kHz）45 min，放冷，加50%乙醇至刻度，搖勻；濾過，精密量取續濾液5 mL，置于25 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過，取續濾液在“2.2”項色譜條件下進樣5 μL，測定，計算回收率，結果見表2。

表2 回收率試驗結果（n＝6）Tab 2Results of recovery tests（n＝6）

2.8 樣品含量測定

取3批樣品（批號分別為20170812、20171216、20180623），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液和對照品溶液各5 μL，在“2.2”項色譜條件下進樣測定，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（mg/片，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（mg/tablet，n＝3）

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

筆者參考文獻[2-4] 和對照品溶液的紫外掃描圖譜（190～400 nm），發現黃芩苷在278 nm、漢黃芩苷在276 nm、黃芩素在272 nm、漢黃芩素在276 nm波長處有最大吸收，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d在210 nm波長處有最大吸收，故本文在滿足含量測定要求的前提下，綜合考慮到峰形、分離度等因素，確定采用HPLC-DAD法，以277、210 nm分別為柴黃片中6種成分含量測定的波長，不但可避免雜質干擾且靈敏度高。

3.2 流動相的選擇

筆者在預試驗過程中并參考文獻[5-9] 方法，分別考察了甲醇-0.05%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸三乙胺水溶液為流動相時進行等度和梯度洗脫對結果的影響。結果顯示，在前4種流動相下各成分峰形和分離度均達不到要求，而以乙腈-磷酸三乙胺水溶液為流動相進行等度和梯度洗脫時，供試品溶液中的各檢測成分色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對稱因子在0.90～1.10，理論板數均大于6 000，故本研究選擇乙腈-磷酸三乙胺水溶液作為流動相進行梯度洗脫。

3.3 提取方法的考察

筆者在進行樣品處理時首先參考了2015年版《中國藥典》（一部）中相應的處理方法[1]，參考相關文獻[10-13] 及該處方的制備工藝，選用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、30%甲醇和50%甲醇作為提取溶劑，分別超聲30、45 min，結果發現，以50%乙醇作為溶劑，超聲處理45 min，黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d提取效率更高，因此本研究選用50%乙醇超聲45 min作為提取方法。

3.4 含量測定6種指標性成分的選擇

柴黃片具有清熱解表功效，臨床上用于風熱感冒引起的發熱等病癥，其主要活性成分為黃酮類和皂苷化學成分，其中黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d 6種成分含量較高[14]。現代藥理學研究表明，黃芩的有效成分均具有廣譜抗菌、抗病毒及良好的抗炎作用，且該作用與黃芩提取物濃度呈正相關，呈現出清熱鎮痛功效[15]。柴胡中的有效成分柴胡皂苷a和柴胡皂苷d也具有解熱、鎮痛、抗炎、抗菌作用[16]。黃芩和柴胡活性明確，其中有效成分含量的高低是衡量柴黃片質量的重要指標，也是影響藥效的主要因素。為了更好地保證柴黃片在臨床使用上的有效性和安全性，故筆者以黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d為指標評價柴黃片的質量更為全面和合理。

3.5 含量結果分析

本試驗對3批柴黃片中的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d進行了含量測定，結果發現，同一廠家不同批號之間含量測定結果有一定的差異，進一步說明了開展多種成分質量控制的中成藥整體控制比以單一指標成分控制中成藥質量更可靠[17]。如果對該藥品進行6種成分的質量控制，就可以從源頭控制藥材質量和制備過程，進而控制柴黃片的質量，保證臨床療效。

綜上，本研究建立了HPLC-DAD法同時測定柴黃片中6種成分含量的方法；按照有效成分不低于3批制劑平均含量80%的要求，建議在柴黃片質量控制標準中，每片含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、柴胡皂苷a和柴胡皂苷d應分別不低于69.0、15.0、8.0、3.0、2.0、1.5 mg。