花生AhPEPC1基因抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代轉(zhuǎn)錄組分析

潘麗娟 陳 娜 陳明娜 王 通 王 冕 陳 靜 楊 珍 萬勇善 禹山林 遲曉元,* 劉風(fēng)珍,*

?

花生基因抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因后代轉(zhuǎn)錄組分析

潘麗娟1陳 娜1陳明娜1王 通1王 冕1陳 靜1楊 珍1萬勇善2禹山林1遲曉元1,*劉風(fēng)珍2,*

1山東省花生研究所, 山東青島 266100;2山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東泰安 271018

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)是控制油料作物種子中蛋白質(zhì)/油脂含量比率的一個關(guān)鍵酶。本研究檢測了花生基因抑制表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系種子含油量, 與非轉(zhuǎn)基因花生相比, 轉(zhuǎn)基因花生種子含油量提高了5.7%~10.3%。利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù)分析花生中基因的抑制表達(dá)是否影響其他基因的功能。結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)錄組分析篩選到110個基因差異表達(dá), 其中25個基因上調(diào)表達(dá), 85個基因表達(dá)下調(diào)。對110個差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG富集分析, 其中有34個基因成功獲得了KEGG注釋, 發(fā)現(xiàn)氨基酸的生物合成途徑中有2個基因(,)下調(diào)表達(dá)。利用熒光定量PCR分析了15個DEG (differential expressed gene)在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因花生種子中的表達(dá)情況, 發(fā)現(xiàn)其趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果基本一致。研究結(jié)果可在一定程度上解析基因調(diào)控花生種子含油量的分子機(jī)制。

花生;基因; 轉(zhuǎn)基因; 轉(zhuǎn)錄組分析

目前我國植物油供需矛盾突出, 自給率不足35%。提高油料作物的含油量是增加油脂產(chǎn)量的有效途徑。花生是我國最重要的油料作物之一, 與大豆、油菜等主要油料作物相比, 花生單位面積產(chǎn)油量最高[1]。花生種子含油量為50%左右[2], 具有進(jìn)一步提高的潛力。

近年來, 隨著花生基因組測序工作的開展、花生轉(zhuǎn)基因技術(shù)的逐步完善, 通過轉(zhuǎn)基因、分子育種手段培育高油花生品種成為可能[2-3]。油脂合成和蛋白質(zhì)合成存在一定的競爭性, 2個代謝過程均需要利用磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)做底物。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)催化丙酮酸合成乙酰-CoA, 進(jìn)入脂肪酸合成途徑, 而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)可催化丙酮酸合成草酰乙酸, 進(jìn)入蛋白質(zhì)合成途徑[4-5]。研究者發(fā)現(xiàn), 油菜、大豆籽仁油脂和蛋白質(zhì)含量與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性密切相關(guān)[6-7]。本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了基因片段反義表達(dá)載體, 通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入花生, 經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化、溫室種植、分子水平檢測篩選等, 獲得3個穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系[8]。本研究在此基礎(chǔ)上, 分析了轉(zhuǎn)基因花生含油量、脂肪酸組分和蛋白質(zhì)含量的變化。

轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)不僅可以用于已知參考基因組的物種測序, 也可用于無參考基因組的物種測序, 進(jìn)行基因表達(dá)水平、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測、可變剪切以及SNP和InDel等諸多方面的分析, 具有結(jié)果準(zhǔn)確性高、敏感度強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組測序可以快速掌握目標(biāo)植物性狀中起重要作用的基因, 促進(jìn)育種或者相關(guān)農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究的進(jìn)程[9-10]。本研究進(jìn)一步利用轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-Seq)技術(shù), 通過轉(zhuǎn)錄組分析來研究轉(zhuǎn)基因花生中基因表達(dá)的變化, 在一定程度上解析了基因調(diào)控花生種子含油量的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花生(L.)品種花育26號由山東省花生研究所提供。本試驗(yàn)分析的轉(zhuǎn)基因株系編號為L6、L11、L21, 非轉(zhuǎn)基因?qū)φ站幪枮閃T。

1.2 穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)基因株系的獲得

實(shí)驗(yàn)室前期以花育26號花生種子中胚軸作為外植體, 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將基因片段反義轉(zhuǎn)入受體花生。轉(zhuǎn)基因T0代植株經(jīng)3代溫室種植, 田間取樣PCR檢測、DNA序列測定以及轉(zhuǎn)錄水平分析等篩選過程, 最終獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因株系3個, 用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 轉(zhuǎn)基因花生含油量、脂肪酸組分和蛋白質(zhì)含量的測定

1.3.1 花生種子含油量測定 采用索氏抽提法測定花生種子含油量, 將預(yù)先烘好的濾紙包稱重(M1), 種子在70℃烘烤后磨樣, 準(zhǔn)確稱量0.5~1.0 g轉(zhuǎn)入濾紙包中, 于105℃烘烤3 h, 稱重(M2), 然后置石油醚中浸泡過夜, 于索氏抽提器中50℃回流8 h, 待油脂完全浸出后, 干燥殘?jiān)? 105℃烘烤3 h并稱重(M3)。種子含油量= (M2-M3)/(M2-M1) × 100%。每個樣品測定3次, 求其平均值。

1.3.2 脂肪酸組分測量 用Agilent 7890A型氣相色譜儀進(jìn)行相對含量測定, FID檢測器, FFAP彈性石英毛細(xì)管柱(50 m × 0.2 mm × 0.33 μm), 恒壓模式, 載氣為高純N2, 流速1 mL min-1; H2流速10 mL min-1, 空氣流速350 mL min-1。進(jìn)樣量1 μL, 分流比10∶1, 進(jìn)樣口溫度250℃, 檢測器溫度250℃。程序升溫自210℃, 9 min; 以9℃ min-1升至230℃, 保持8 min。

1.3.3 花生種子蛋白含量測定 取0.5 g左右的花生種子磨碎樣品, 采用凱氏定氮儀(Kjeltec TM2300, FOSS, Danmark)測定蛋白含量。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

取T3代轉(zhuǎn)基因株系L21與對照花生發(fā)育中期的種子(莢果形成40 d), 各3個生物學(xué)重復(fù)(測序代號分別為TL1、TL2、TL3、WT1、WT2、WT3), 委托北京諾禾致源生物信息科技有限公司利用Illumina HiSeq 4000測序。高通量測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識別(Base Calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測序序列(Raw Data或Raw Reads)。

1.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

將測序過濾后得到的 clean data 數(shù)據(jù)與花生()參考基因組序列(http://peanutbase.org/)通過序列比對軟件Tophat2比對。利用目前最為常用的基因表達(dá)水平估算方法FPKM (expected number of Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced)來估算[11]。一般情況下,有參轉(zhuǎn)錄組當(dāng)中, 認(rèn)為FPKM>1是基因表達(dá)的。本試驗(yàn)中差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)是Fold change ≥2, padj (校正后的value)<0.05。

Gene Ontology (簡稱 GO, http://www.geneontology.org/)是基因功能國際標(biāo)準(zhǔn)分類體系。GO分為分子功能(Molecular Function)、生物過程(Biological Process)和細(xì)胞組成(Cellular Component) 3個部分。

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是系統(tǒng)分析基因功能、基因組信息數(shù)據(jù)庫, 它有助于研究者把基因及表達(dá)信息作為一個整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。通過Pathway顯著性富集能確定差異表達(dá)基因參與的最主要生化代謝途徑和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR分析

選擇15個差異表達(dá)基因, 用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1), 以為內(nèi)參基因, 進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR分析。每個樣品進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù), 用2–DDCT法對樣本基因進(jìn)行表達(dá)差異相對定量分析。

表1 熒光定量PCR的引物序列

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel對試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhPEPC1基因的抑制表達(dá)對花生種子含油量、脂肪酸含量和蛋白含量的影響

非轉(zhuǎn)基因花生(對照)種子含油量為50.5%, 轉(zhuǎn)基因系L6、L11和L21種子的含油量分別為53.4%、54.2%、55.7%。與對照相比, 轉(zhuǎn)基因花生的含油量提高了5.7%~10.3% (圖1-A)。棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸、花生酸、花生四烯酸等脂肪酸成分相對含量在轉(zhuǎn)基因株系和對照中沒有明顯差異(圖1-C)。說明轉(zhuǎn)基因只提高了花生種子含油量, 沒有改變脂肪酸成分組成。

對照種子蛋白含量為23.5%, 轉(zhuǎn)基因系L6、L11和L21種子的蛋白含量分別為21.7%、20.5%和19.5%。與對照相比, 轉(zhuǎn)基因花生的蛋白含量降低了7.5%~17.0% (圖1-B)。上述結(jié)果表明, 轉(zhuǎn)基因花生的成熟種子隨著油脂含量的增加, 蛋白含量有所下降。可推測基因在花生中抑制表達(dá), 減少了碳源向蛋白合成方向的分配, 從而降低了種子蛋白含量, 同時在一定程度上增加了合成油脂的碳流分配量, 提高了種子含油量。

2.2 轉(zhuǎn)基因花生的RNA-Seq測序及分析

利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù), 分析轉(zhuǎn)基因花生中基因的抑制表達(dá)是否影響其他基因的功能。分析結(jié)果顯示, 對照花生樣品WT中共有17,928個基因表達(dá), 轉(zhuǎn)基因花生樣品TL中共有17,839個基因表達(dá), 其中有17,418個基因是WT和TL共同表達(dá)的, 有510個基因是WT特有表達(dá), 有421個基因是TL特有表達(dá)(圖2)。在轉(zhuǎn)基因和對照花生樣品中, 篩選到110個基因差異表達(dá), 其中25個基因表達(dá)上調(diào), 85個基因表達(dá)下調(diào)(圖3)。

圖1 轉(zhuǎn)基因株系和對照花生種子含油量(A)、蛋白含量(B)和脂肪酸含量(C)

WT: 對照; L6、L11、L21: 轉(zhuǎn)基因株系。a、b、c、d的柱值在處理間差異顯著(= 0.05)。

WT: control plants; L6, L11, L21: transgenic plants. Bars superscripted by different letters are significant different at= 0.05.

圖2 基因表達(dá)維恩圖

WT: 對照; TL: 轉(zhuǎn)基因株系。每個大圓圈中的數(shù)字之和代表該group表達(dá)了的基因總個數(shù), 圓圈交疊的部分表示group之間共有的表達(dá)基因。

WT: control plants; TL: transgenic plants. The sum of the numbers in each large circle represents the total number of genes expressed in the group, the overlapping circles represent common genes between groups.

2.3 差異基因GO富集分析

對110個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能顯著性富集分析, 差異基因GO富集柱狀圖, 直觀地反映出在生物過程、細(xì)胞組分和分子功能富集的GO term上差異基因的個數(shù)分布情況。本研究挑選了富集最顯著的30個GO term (圖4)。在生物過程部分中, 差異表達(dá)基因幾乎平均分布在23個GO term中, 其中己糖代謝過程(hexose metabolic process)功能組中含有2個基因, 磷脂酰肌醇(-3)激酶信號(phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、磷脂酰肌醇(-3)激酶信號的調(diào)控(regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)等22個功能組各含有1個基因。在細(xì)胞組成部分, 差異表達(dá)基因分布在4個GO term中，細(xì)胞質(zhì)(cytosol)及胞質(zhì)部分(cytosolic part)功能組各含有2個基因。在分子功能部分, 差異表達(dá)基因分布在3個GO term中，其中核苷磷酸酶活性(nucleotide phosphatase activity)功能組含有3個基因, 磷脂酰肌醇(-3)激酶結(jié)合(phosphatidylinositol 3-kinase binding)和磷酸甘油酸變位酶活性(phosphoglycerate mutase activity)功能組各含有1個基因。

2.4 差異基因KEGG富集分析

對110個差異表達(dá)基因進(jìn)行了KEGG功能注釋和pathway顯著性富集分析, 其中有34個基因成功獲得了 KEGG注釋(表2)。Pathway顯著性富集分析結(jié)果顯示, 差異基因多定位在光合作用、嘌呤代謝、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、氨基酸的生物合成、次生代謝產(chǎn)物生物合成、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等23個途徑。其中氨基酸的生物合成中有2個基因(,)下調(diào)表達(dá)(圖5和圖6)。說明轉(zhuǎn)基因花生中基因的抑制表達(dá), 可能引起碳源向蛋白合成方向分配的減少, 從而使氨基酸生物合成途徑中有些基因的表達(dá)下降。這與轉(zhuǎn)基因花生中蛋白含量降低的結(jié)果吻合。這個結(jié)果需要后續(xù)功能試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

圖3 差異基因火山圖

adj< 0.05為差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)。有顯著性差異表達(dá)的基因用紅色點(diǎn)(上調(diào))和綠色點(diǎn)(下調(diào))表示, 無顯著性差異表達(dá)的基因用藍(lán)色點(diǎn)表示。

The screening standard of differential genes isadj< 0.05. Red dots indicate the up-regulated genes with significant differences, green dots indicate the down regulated genes with significant differences, no significant difference in the expression of genes with blue dots.

圖4 GO富集分類圖

縱坐標(biāo)為富集的GO term, 橫坐標(biāo)為該term中差異基因個數(shù)。綠色表示生物過程, 橙色表示細(xì)胞組分, 紫色表示分子功能。

The ordinate is the enriched GO term, the abscissa is the number of differential genes in term. The green represents the biological process, the orange represents the cell component, and the purple represents the molecular function.

圖6 氨基酸合成途徑中基因相對表達(dá)量

2.5 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq所測結(jié)果的準(zhǔn)確性, 利用熒光定量PCR分析了15個DEG (differential expressed gene)在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因花生莢果形成中期的種子中的表達(dá)情況。結(jié)果表明, 15個DEG在RNA- Seq和 RT-PCR中的表達(dá)模式基本是一致的, 但基因表達(dá)水平的變化幅度有一定差異(表3), 說明轉(zhuǎn)錄組測序分析結(jié)果是可靠的。

表3 RNA-seq與RT-PCR驗(yàn)證倍數(shù)差別

3 討論

花生籽仁中貯藏的物質(zhì)(包括油脂、蛋白質(zhì)、糖類等)來源于光合碳同化的原初產(chǎn)物, 花生油脂代謝與其他能量物質(zhì)的代謝是普遍聯(lián)系和交織的, 抑制這些代謝競爭途徑可以增加參與油脂合成的碳流, 提高含油量[12-13]。油脂合成與蛋白質(zhì)合成2個代謝過程均需要利用糖酵解產(chǎn)物磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate, PEP)作底物。研究者發(fā)現(xiàn), 大豆籽仁油脂和蛋白質(zhì)含量與磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)活性密切相關(guān)[14-16]。也有研究指出, 油菜種子中PEPC活性與種子的TAG和脂肪酸含量之間有一定的關(guān)系[17-18]。Chen等[6]提出“底物競爭”假說, 認(rèn)為油脂和蛋白質(zhì)均來自葡萄糖糖酵解產(chǎn)物丙酮酸, PEPC酶催化丙酮酸合成草酰乙酸, 進(jìn)入蛋白質(zhì)合成途徑; 而ACCase酶可催化丙酮酸合成乙酰-CoA,進(jìn)入脂肪酸合成途徑。一般認(rèn)為PEPC酶和ACCase酶的相對活性決定了二者競爭的平衡點(diǎn)。在油菜中通過反義抑制基因的表達(dá), 獲得了含油量提高6.4%~18.0%的轉(zhuǎn)基因油菜, 轉(zhuǎn)化植株油脂含量與蛋白質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)。

本研究將反義基因轉(zhuǎn)化花生, 獲得了含油量提高5.7%~10.3%的轉(zhuǎn)基因花生。轉(zhuǎn)基因花生的脂肪酸成分相對含量未發(fā)生改變, 但蛋白含量降低了7.5%~17.0%。研究結(jié)果也說明了花生種子中油脂含量與蛋白含量是相互制約的。基因的抑制表達(dá)能明顯提高花生含油量, 轉(zhuǎn)基因植株又能正常生長發(fā)育, 表明利用該基因通過轉(zhuǎn)基因途徑提高油料作物種子含油量具有良好的科研價值和應(yīng)用前景。

RNA-Seq測序技術(shù)可以在植物轉(zhuǎn)錄組水平上對基因的表達(dá)情況進(jìn)行準(zhǔn)確、全面的研究, 特別是對轉(zhuǎn)基因植株或目標(biāo)性狀突變體植株的轉(zhuǎn)錄組分析, 可以揭示單個目標(biāo)基因的變化對植物體性狀帶來的各種影響[19]。本研究對轉(zhuǎn)基因株系和對照花生發(fā)育中期的種子進(jìn)行了RNA-Seq測序分析, 篩選到110個基因差異表達(dá), 其中25個基因上調(diào)表達(dá), 85個基因表達(dá)下調(diào), 但是其中有28.2%的基因在花生基因組數(shù)據(jù)庫中沒有找到注釋信息, 說明存在著大量未知基因信息。差異基因的KEGG富集分析結(jié)果顯示, 氨基酸的生物合成途徑中有2個基因(,)下調(diào)表達(dá), 說明轉(zhuǎn)基因花生中基因的抑制表達(dá), 可能引起碳源向蛋白合成方向分配的減少, 使氨基酸生物合成途徑中有些基因的表達(dá)下降, 從而使轉(zhuǎn)基因花生蛋白質(zhì)含量降低, 這些分析結(jié)果還需開展后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

花生基因的抑制表達(dá)可影響轉(zhuǎn)基因后代種子含油量和蛋白含量。與對照相比, 轉(zhuǎn)基因花生含油量提高了5.7%~10.3%, 蛋白質(zhì)含量降低了7.5%~17.0%。轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)初步分析了基因抑制表達(dá)對相關(guān)基因表達(dá)的影響, 其中轉(zhuǎn)基因花生氨基酸的生物合成途徑中有2個基因(,)下調(diào)表達(dá), 與轉(zhuǎn)基因花生蛋白含量降低的結(jié)果吻合。

[1] 萬書波. 花生產(chǎn)業(yè)形勢與對策. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 46(10): 128–132. Wan S B. Situation and developing strategies of peanut industry., 2014,46(10): 128–132 (in Chinese with English abstract).

[2] Chen X, Li H, Pandey M K, Yang Q, Wang X, Garg V, Li H, Chi X, Doddamani D, Hong Y, Upadhyaya H, Guo H, Khan A W, Zhu F, Zhang X, Pan L, Pierce G J, Zhou G, Krishnamohan K A, Chen M, Zhong N, Agarwal G, Li S, Chitikineni A, Zhang G Q, Sharma S, Chen N, Liu H, Janila P, Li S, Wang M, Wang T, Sun J, Li X, Li C, Wang M, Yu L, Wen S, Singh S, Yang Z, Zhao J, Zhang C, Yu Y, Bi J, Zhang X, Liu Z J, Paterson A H, Wang S, Liang X, Varshney R K, Yu S. Draft genome of the peanut A-genome progenitor () provides insights into geocarpy, oilbiosynthesis, and allergens., 2016, 113: 6785–6790.

[3] Bertioli D J, Cannon S B, Froenicke L, Huang G, Farmer A D, Cannon E K S, Liu X, Gao D, Clevenger J, Dash S, Ren L, Moretzsohn M C, Shirasawa K, Huang W, Vidigal B, Abernathy B, Chu Y, Niederhuth C E, Umale P, Araujo A C G, Kozik A, Do Kim K, Burow M D, Varshney R K, Wang X, Zhang X, Barkley N, Guimaraes P M, Isobe S, Guo B, Liao B, Stalker H T, Schmitz R J, Scheffler B E, Leal-Bertioli S C M, Xun X, Jackson S A, Michelmore R, Ozias-Akins P. The genome sequences ofand, the diploid ancestors of cultivated peanut., 2016, 48: 438–446.

[4] Rolletschek H, Borisjuk L, Radchuk R, Miranda M, Heim U, Wobus U, Weber H. Seed-specific expression of a bacterial phosphoenolpyruvate carboxylase inincreases protein content and improves carbon economy., 2004, 2: 211–219.

[5] Song D, Fu J, Shi D. Exploitation of oil-bearing microalgae for biodiesel., 2008, 24: 341–348.

[6] 陳錦清, 郎春秀, 胡張華, 劉智宏, 黃銳之. 反義基因調(diào)控油菜籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率的研究. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報, 1999, 7: 316–320. Chen J Q, Lang C X, Hu Z H, Liu Z H, Huang R Z. Antisensegene regulates to ratio of protein and lipid content inseeds., 1999, 7: 316–320 (in Chinese with English abstract).

[7] Sugimoto T, Kawasaki T, Kato T, Whittier R F, Shibata D, Kawamura Y. cDNA sequence and expression of a phosphoenolpyruvate carboxylase gene from soybean., 1992, 20: 743–747.

[8] Pan L J, Zhang J C, Chi X Y, Chen N, Chen M N, Wang M, Wang T, Yang Z, Zhang Z M, Wan Y S, Yu S L, Liu F Z. The antisense expression ofincreases seed oil production in peanuts (L.)., 2016, 67(4): e164.

[9] Sharma N, Anderson M, Kumar A, Zhang Y, Giblin E M, Abrams S R, Zaharia L I, Taylor D C, Fobert P R. Transgenic increases in seed oil content are associated with the differential expression of novel Brassica-specific transcripts., 2008, 9: 619, doi: 10.1186/1471-2164-9-619.

[10] Liu J, Hua W, Yang H L, Zhan G M, Li R J, Deng L B, Wang X F, Liu G H, Wang H Z. Thegene (-like gene from) enhances seed oil production through regulating cell number and plant photosynthesis., 2012, 63: 3727–3740.

[11] Trapnell C, Williams B A, Pertea G, Mortazavi A, Kwan G, van Baren M J, Salzberg S L, Wold B J, Pachter L. Transcript assembly and quantification by RNA-seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation., 2010, 28: 511–515.

[12] Ruuska S A, Girke T, Benning C, Ohlrogge J B. Contrapuntal networks of gene expression duringseed filling., 2002, 14: 1191–1206.

[13] Uhrig R G, O’Leary B, Spang H E, MacDonald J A, She Y M, Plaxton W C. Coimmunopurification of phosphorylated bacterial- and plant-type phosphoenolpyruvate carboxylases with the plastidial pyruvate dehydrogenase complex from developing castor oil seeds., 2008, 146: 1346–1357.

[14] Sugimoto T, Tanaka K, Monma M, Kawamura Y, Saio K. Phosphoenolpyruvate carboxylase level in soybean seed highly correlates to its contents of protein and lipid., 1989, 53: 885–887.

[15] Vazquez-Tello A, Whittier R P, Kawasaki T, Sugimoto T, Kawamura Y, Shibata D. Sequence of a soybean (L.) phosphoenolpyruvate carboxylase cDNA., 1993, 103: 1025–1026.

[16] 張占琴, 王金梅, 王學(xué)軍, 汪凱華, 袁春新, 麻浩. 油菜籽粒發(fā)育過程中PEPCase活性與油脂, 蛋白質(zhì)及亞基積累的特點(diǎn). 中國油料作物學(xué)報, 2009, 31: 14–18. Zhang Z Q, Wang J M, Wang X J, Wang K H, Yuan C X, Ma H. The characteristics of PEPCase activity and accumulation of oil, protein and major protein subunits during seed development of rape ()., 2009, 31: 14–18 (in Chinese with English abstract).

[17] Ward J K, Tissue D T, Thomas R B, Strain B R. Comparative responses of model C3and C4plants to drought in low and elevated CO2., 1999, 5: 857–867.

[18] Nayyar H, Gupta D. Differential sensitivity of C3and C4plants to water deficit stress: association with oxidative stress and antioxidants., 2006, 58: 106–113.

[19] Brown A P, Kroon J T, Swarbreck D, Febrer M, Larson T R, Graham I A, Caccamo M, Slabas A R. Tissue-specific whole transcriptome sequencing in castor, directed at understanding triacylglycerol lipid biosynthetic pathways., 2012, 7: e301

Transcriptome analysis of the peanut transgenic offspring with depressinggene

PAN Li-Juan1, CHEN Na1, CHEN Ming-Na1, WANG Tong1, WANG Mian1, CHEN Jing1, YANG Zhen1, WAN Yong-Shan2, YU Shan-Lin1, CHI Xiao-Yuan1,*, and LIU Feng-Zhen2,*

1Shandong Peanut Research Institute, Qingdao 266100, Shandong, China;2College of Agronomy, Shandong Agricultural University / National Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, Shandong, China

Phosphoenolpyruvate carboxylase is considered as a key enzyme to control the ratio of protein to lipid of oilseeds. In this study, the antisense expression of the peanut PEPC isoform 1 () gene increased the lipidcontent by 5.7%–10.3% compared with the non-transgenic control. The high-throughput sequencing technology — RNA-Seq was used to analyze whether the inhibitory expression ofgene in peanut affected the function of other genes. The results showed that 110 genes were differentially expressed, of which 25 genes were up-regulated and 85 genes were down-regulated. KEGG enrichment analysis was performed on 110 differentially expressed genes, among which 34 genes were successfully obtained KEGG annotation, and two genes (and) were down-regulated in the biosynthesis pathway of amino acids. Fifteen DEGs between non-transgenic control and transgenic peanut seeds were selected to analyze the gene expression levels using qRT-PCR. The results of qRT-PCR agreed well with most findings from RNA-seq analysis. This research might resolve to some extent the molecular mechanisms ofgene regulating oil content of peanut seeds.

peanut;gene; transgenic; transcriptome analysis

2018-09-20;

2019-01-19;

2019-03-22.

10.3724/SP.J.1006.2019.84122

劉風(fēng)珍, E-mail: liufz@sdau.edu.cn; 遲曉元, E-mail: chi000@126.com

E-mail: panlijuan_2008@aliyun.com

本研究由2014年國家“萬人計劃”青年拔尖人才(W02070268), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-13), 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31701464), 山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2017YL017, ZR2016CM07), 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年科研基金項(xiàng)目(2016YQN14), 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年英才培養(yǎng)計劃, 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程(CXGC2016B02, CXGC2018E21), 青島市應(yīng)用研究專項(xiàng)青年專項(xiàng)(17-1-1-51-jch), 山東省良種工程(2017LZGC003)和泰山學(xué)者工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助。

This study was supported by the Grants from the National Ten Thousand Youth Talents Plan of 2014 (W02070268), the China Agriculture Research System (CARS-13), the National Natural Science Foundation of China (31701464), the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2017YL017, ZR2016CM07), the Youth Scientific Research Foundation of Shandong Academy of Agricultural Sciences (2016YQN14), Young Talents Training Program of Shandong Academy of Agricultural Sciences, Agricultural Scientific and Technological Innovation Project of Shandong Academy of Agricultural Sciences (CXGC2016B02, CXGC2018E21), the Basic Research Project of Qingdao (17-1-1-51-jch), Improved Variety Engineering Project of Shandong Province (2017LZGC003), and Taishan Scholars Project.

URL: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20190321.1400.004.html