響應面法優化莜麥蛋白提取工藝

寧 芯，王國澤 ，墨紫梅，汪 磊

（1.玉林師范學院化學與食品科學學院，廣西玉林 537000；2.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗室，廣西玉林 537000；3.內蒙古科技大學生命科學與技術學院，內蒙古包頭 014010；4.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西南寧 530001）

莜麥又稱裸燕麥，起源于我國，在我國高寒地區糧食生產中占有重要地位[1]。莜麥是世界公認營養價值很高的糧種之一[2-3]，且頗具保健療效[4-6]。隨著生活水平的提高和對營養概念的不斷認識，莜麥制品正日益受到人們的青睞，現已被廣泛應用于食品、飼料、醫藥、化妝品和工業原料等領域[7-9]。

莜麥蛋白是優質的蛋白質資源，具有良好的開發前景。莜麥中蛋白質含量高達11.4%～19.9%，居禾谷類作物之首[1，10]。莜麥蛋白質是谷物中氨基酸組成最平衡的蛋白質之一，其氨基酸含量多且種類齊全，配比合理，人體利用率高，其中人體必需的8種氨基酸是小麥的2倍多，且含有較多兒童發育不可缺少的組氨酸和賴氨酸[11-12]。經常攝入莜麥食品，可以有效改善我國傳統膳食引起的賴氨酸缺乏癥。

蛋白質常采用堿法提取，該方法比較成熟。當前，堿法提取莜麥蛋白的研究較少，試驗研究莜麥蛋白的堿法提取工藝，在單因素基礎上，采用響應面法優化莜麥蛋白的提取工藝，以期為莜麥蛋白的提取和莜麥資源的加工利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

莜麥（蒙燕7413），產于內蒙古武川縣。

石油醚，分析純，天津永大化學試劑有限公司提供；氫氧化鈉，分析純，天津市華東試劑廠提供；鹽酸，分析純，天津市振興化工試劑廠提供；無水乙醇，分析純，天津市永天化學試劑有限公司提供；牛血清蛋白，北京拜爾迪生物公司提供；考馬斯亮藍，分析純，北京化學試劑公司提供。

DFT-200型手提式高速萬能粉碎機，溫嶺市林大機械有限公司產品；JA5003型電子分析天平，上海越平科技儀器有限公司產品；L-550型臺式低速大容量離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司產品；PHS-3B型雷磁pH計，上海精密科學儀器有限公司產品；UV-7504型單光束紫外-可見分光光度計，上海欣茂儀器有限公司產品；KDN-08A型定氮儀，上海昕瑞儀器儀表有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 莜麥蛋白的提取工藝

莜麥蛋白堿提法：莜麥籽粒→磨粉→過篩→石油醚脫脂→脫脂莜麥粉→調漿→調pH值→堿法提取→過濾→提取液→含量測定。

莜麥粉碎后過100目篩，加入正己烷浸泡脫脂，脫脂后的莜麥粉干燥后粉碎得脫脂莜麥粉。精確稱取5.00 g脫脂莜麥粉置于三角瓶中，按一定料液比加蒸餾水，并用1 mol/L的NaOH溶液調pH值，在一定溫度下浸提一定時間，以轉速3 500 r/min離心15 min，分離上清液，通過考馬斯亮藍法測定上清液中的蛋白質含量，并計算堿法提取莜麥蛋白的提取率。

1.2.2 莜麥蛋白提取率的計算

采用凱氏定氮法測定脫脂莜麥粉中總蛋白的含量，通過考馬斯亮藍G-250染色法測定提取液中蛋白質含量[13]。

1.2.3 統計處理

所有數據應用Excel軟件、SPSS軟件和Designer Expert軟件進行處理和分析。其中，顯著性分析采用Duncan檢驗，p＞0.05判定為變化不顯著，p＜0.05判定為變化顯著。

2 結果與分析

2.1 莜麥蛋白提取單因素試驗

以莜麥蛋白提取率為指標，分別研究浸提pH值8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5；提取溫度 30，35，40，45，50 ℃；提取時間 0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h；料液比 1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25對莜麥蛋白提取率的影響。

單因素試驗見圖1。

由圖1可知，提取溫度、浸提pH值、料液比和提取時間對莜麥蛋白提取率均有顯著性影響。顯著性分析結果表明浸提溫度為45℃，浸提pH值9.5，料液比1∶10，提取時間1.0 h時，莜麥蛋白提取率最高。

圖1 單因素試驗

2.2 莜麥蛋白堿提工藝優化

在單因素試驗結果的基礎上，采用響應面法對莜麥蛋白堿提工藝進行優化。

Box-Behnken方案設計的因素與水平設計見表1，莜麥蛋白堿法提取工藝優化響應面試驗方案與試驗結果見表2。

表1 Box-Behnken方案設計的因素與水平設計

表2 莜麥蛋白堿法提取工藝優化響應面試驗方案與試驗結果

利用Design Expert軟件對表2的數據進行多元回歸擬合，得到莜麥蛋白提取率對提取溫度（A）、浸提pH值（B）、料液比（C） 和提取時間（D） 的回歸方程：

回歸方程的方差分析見表3。

表3 回歸方程的方差分析

由表3可知，模型p=0.000 1＜0.01，試驗所選用的模型具有高度的顯著性，失擬項p=0.056 5＞0.05不顯著，決定系數R2=0.898 3，說明擬合程度良好、試驗誤差小，該模型可以用來預測莜麥蛋白的提取率，模型中A，C，C2極顯著，B，D，D2顯著。其他項系數均不顯著。在所選取的各因素水平范圍內，按照對結果的影響排序，C＞A＞B＞D，即料液比＞提取溫度＞浸提pH值＞提取時間。

兩因素交互作用對莜麥蛋白提取率的響應面圖和等高線圖見圖2。

圖2 兩因素交互作用對莜麥蛋白提取率的響應面圖和等高線圖

等高線是橢圓形，則表示兩因素交互作用顯著；等高線是圓形則表示交互作用不顯著，同時沿因素軸向等高線變化越密集，該因素對響應值影響越顯著，反之越弱。根據分析結果做出響應面曲面圖及等高線圖。通過Design Expert軟件得到莜麥蛋白堿提的最佳參數為提取溫度40℃，浸提pH值9.65，料液比1∶11.66，提取時間1.15 h，預測值4.64%。對優化的條件進行驗證試驗，在此條件下莜麥蛋白堿提法提取率為62.02%。與理論預測值吻合，因此基于響應面法所得的優化提取參數準確可靠。

3 結論

應用響應面分析法優化莜麥蛋白堿法提取工藝，結果表明，提取溫度、浸提pH值、料液比和提取時間對莜麥蛋白提取率均有顯著性影響。影響莜麥蛋白堿法提取率的因素次序為料液比＞提取溫度＞浸提pH值＞提取時間。堿法提取莜麥蛋白的最佳工藝參數為提取溫度40℃，浸提pH值9.65，料液比1∶11.66（g∶mL），提取時間1.15 h，在此條件下莜麥蛋白的提取率為62.02%，