植物乳桿菌P48生物轉化制備γ-氨基丁酸特性研究

郭潔兒，鄧潔瑩，駱雨雨，張淑晶，李 云

（韓山師范學院食品工程與生物科技學院，廣東潮州 521041）

γ-氨基丁酸 （γ-aminobutyric acid，GABA） 是一種經谷氨酸脫羧酶 （Glutamatedecarboxylase，GAD） 催化L-谷氨酸 （L-glutamic acid） 脫羧生成的天然非蛋白質氨基酸[1]。作為一種重要的抑制性神經遞質，GABA在中樞神經系統中發揮作用。越來越多的研究表明，GABA具有很多對人類健康有益的生理功能，包括抗高血壓、鎮靜、抗糖尿病、抗肥胖和抗癌等[2]。

制備GABA的方法主要有化學合成法和生物合成法兩大類。化學合成法不適合制備作為食品功能添加劑的GABA，因為化學合成過程中使用的有毒化學品可能殘留在最終產品中[3]。生物合成法是利用具有GAD活性的微生物合成GABA，與化學合成法相比，生物合成方法更容易實施，有更好的安全性，并且能在高選擇性和更少的副產物條件下獲得產生理想的產量。生物合成法包括微生物細胞生物轉化法和微生物發酵法2種。利用微生物（特別是GAD活性高的乳酸菌）的細胞生物轉化是大規模GABA生產的一種很有前途的技術，具有反應時間短、工藝簡單、后續分離純化容易等優勢，近年來受到了廣泛的關注。微生物細胞轉化法，先通過培養細胞，得到細胞懸液后離心去掉培養基，再制備菌懸液與底物等反應，簡化了反應體系，有利于下游GABA的分離純化。目前，利用乳酸菌生物轉化制備GABA已有報道，采用的菌種有戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）[4]、短乳桿菌 （Lactobacillus brevis）[5]和嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）[6]等。植物乳桿菌（L.plantarum） 是一種食品級安全的乳酸菌菌株，利用植物乳桿菌制備GABA，是比較安全、理想的途徑。試驗以從發酵食品中分離的1株高GAD活性的植物乳桿菌P48作為菌種，研究了P48細胞生物轉化法制備GABA的特性。通過在不同pH值、溫度、底物濃度和產物濃度的條件下進行反應，探究反應的最佳條件，使得轉化液中的GABA中產量達到最高，將為植物乳桿菌P48在大規模轉化制備GABA提供有效的試驗參考數據。

1 材料與方法

1.1 試劑

γ-氨基丁酸（純度99.5%）、谷氨酸—鈉鹽（L-MSG純度為99.5%），配制培養基用胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉為生化試劑，其他均為分析純試劑。

1.2 菌種和培養基

1.2.1 菌種

分離于自然發酵酸菜，由發酵實驗室保藏。

1.2.2 培養基

改良PSB培養基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母粉2.5 g，葡萄糖20 g，乙酸鈉0.83 g，吐溫1 g，L-MSG 10 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值 6.8～7.0，于121℃條件下滅菌20 min。用于培養生物轉化用細胞。

1.3 方法

1.3.1 菌種培養與菌懸液的制備

取保藏菌種，按1%接種量接種于含有6 mL的PSB培養液的試管中，于37℃條件下靜置培養24 h。活化后，將菌種按1%接種量再接入30 mL的PSB培養液的三角瓶中，制得種子培養液。按照2%的接種量，接種于200 mL的PSB液體培養基，于37℃條件下靜置培養。

每100mL發酵液于4℃條件下，以轉速10000r/min離心10 min，用10 mL的生理鹽水洗滌菌體2次，然后再加10 mL生理鹽水制成菌懸液。所得菌懸液，平均分為2組，一組用作細胞轉化反應；另一組在冰浴條件下超聲波破碎20 min（每次5 s工作，10 s間歇），破碎后在4℃下以轉速10 000 r/min離心5 min，取上清液用作粗酶液。

1.3.2 不同pH值對P48細胞轉化和粗酶轉化活性的影響

L-MSG溶解于0.4 mol/L乙酸-乙酸鈉緩沖液，分別配制成pH值分別為2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5的200 mmol/L L-谷氨酸—鈉底物溶液。分別加入菌懸液和粗酶液進行反應。反應體系總體積4 mL，含2 mL蒸餾水、1 mL菌懸液（或粗酶液）和1 mL底物溶液。置于37℃水浴中反應，5 h后取樣。

1.3.3 不同溫度對P48細胞轉化和粗酶轉化活性的影響

在底物溶液濃度為200 mmol/L，于pH值4.5條件下進行細胞和粗酶液反應，分別置于25，30，35，40，45，50℃的條件下反應5 h后取樣。

1.3.4 不同底物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化活性的影響

在溫度40℃，pH值4.5的條件下，分別采用25，50，75，100，150 mmol/L的初始底物濃度進行細胞和粗酶轉化反應，反應5 h后取樣。

1.3.5 不同產物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化活性的影響

在初始反應體系中加入不同量的GABA，使GABA初始濃度分別為5，10，20，40，60，80 mmol/L。按上述試驗所得最佳條件，分別進行細胞和粗酶液反應，轉化5 h后取樣。

1.3.6 GABA含量的測定

參照文獻[7]采用高效液相色譜法對轉化液中的GABA進行定量分析。

2 結果與分析

2.1 pH值對P48細胞轉化和粗酶轉化反應活性的影響

在不同的pH值條件下分別測定P48細胞菌懸液及其粗酶液轉化反應所得的GABA含量。

pH值對P48細胞轉化和粗酶液活性的影響見圖1。

圖1 pH值對P48細胞轉化和粗酶液活性的影響

由圖1可知，在使用粗酶液的轉化反應中，P48粗酶的最適pH值為5.0。而在P48細胞轉化反應中，pH值3.5～4.0時的GABA產量快速上升；在pH值4.0～5.5，雖然其產量有下降，但下降較為緩慢；pH值達到6.0時，其GABA的產量仍保持在60%，因此P48細胞轉化反應的最適pH值為4.0。對比2組曲線，在各自反應的最適pH值條件下，采用粗酶液轉化的GABA產量比采用細胞的高。由于GAD是胞內酶，利用細胞轉化制備GABA時，底物需通過運送蛋白（Antiporter）運送到細胞內，在胞質經GAD發生脫羧反應生成GABA，生成的GABA再由運送蛋白運送出細胞外[5]。細胞轉化過程在一定程度上受底物和產物傳質阻力的影響，而粗酶液組中的GAD可直接與體系中的底物反應，因此采用粗酶液的GABA產量較細胞轉化高。從維持高酶活的pH值范圍來看，細胞轉化反應在pH值4.0～5.5時，GABA的產量相差不大，而粗酶液組在pH值高于或低于5.0，GABA的產量都急劇下降，可見P48細胞菌懸液組適應的pH范圍更寬廣。當外界環境的pH值發生變化時，細胞內的pH值仍能維持一定的生理平衡，因此胞內GAD的活性受pH值的影響較低。而粗酶液的GAD經細胞破碎后釋放到胞外，失去了細胞的保護，對pH值的變化較為敏感。P48細胞適應pH值范圍更寬，有利于生產條件的調控，更適用于大規模生產。

2.2 溫度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響

溫度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響見圖2。

圖2 溫度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響

由圖2可知，P48粗酶轉化的最適溫度為40℃。P48細胞轉化反應的GABA產量在25～45℃時不斷增長，溫度超過45℃后，其產量有所降低，但降低幅度不大。50℃時，產量仍保持70%左右，所以P48細胞菌懸液組的反應最適溫度為45℃。對比2組曲線，溫度高于或低于40℃時，使用粗酶的反應GABA產量都下降很快，溫度達到50℃時，轉化液中的GABA產量降到了40%，采用粗酶反應對溫度較敏感，受溫度的影響大。而在細胞反應中40～50℃時，GABA的產量差異不大，溫度達到50℃時，產量仍有70%。由此可見，采用細胞進行轉化反應有更寬的溫度耐受范圍。從已有文獻看，龔福明等人[8]報道植物乳桿菌YM-4-3發酵法制備GABA的最佳溫度為35℃，李理[9]研究了植物乳桿菌ATCC14917發酵制備GABA的最佳溫度為40℃，渠巖等人[10]對研究了醬油后酵中植物乳桿菌S35發酵產GABA的條件，報道其最佳反應溫度為35℃。試驗結果表明，植物乳桿菌P48轉化制備GABA最適溫度45℃比上述的植物乳桿菌菌株的略高，說明P48在轉化過程中的GAD活性能耐受較高溫度，可以在較高溫度條件下進行轉化反應，在一定程度上可以抑制轉化體系中常見的雜菌生長，更有利于實際的大規模生產。

2.3 底物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響

底物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響見圖3。

圖3 底物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響

當底物濃度為25～50 mmol/L時，粗酶轉化液中的GABA產量隨底物濃度的增大而增加較快，當底物濃度大于50 mmol/L后，GABA的產量隨底物濃度增大而減少，底物濃度達到150 mmol/L時，GABA降低到了60%以下，因此P48粗酶液的最佳反應底物濃度為50 mmol/L。在P48細胞轉化反應在底物濃度為25～100 mmol/L時，轉化液中的GABA含量亦隨著底物濃度增大而增大。當底物濃度大于100 mmol/L后，GABA產量開始下降，但下降速度緩慢，底物濃度為150 mmol/L時，GABA產量仍有80%，所以P48細胞反應的最適底物濃度為100 mmol/L。對比2組曲線，2組的最高產量相差不大。但2組最適底物濃度不一樣，而且細胞反應組在底物濃度75～150 mmol/L時產量仍保持80%。而粗酶反應組的GABA產量一直呈下降趨勢。底物濃度過高時對酶有抑制作用，過量的底物分子可作為反競爭性抑制劑。當粗酶液的底物濃度達到體系最大承受容量時，轉化反應會受到抑制作用。而細胞轉化反應中由于細胞的保護作用，限制了底物的進入量，從而減低了底物對GAD的抑制，細胞轉化反應的GAD酶活受底物抑制程度較低。因此，利用細胞轉化反應制備GABA，可以用更高濃度的底物，減少投料次數，省時省力并且可以減少生產成本，更適合用于大規模生產GABA。

2.4 產物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響

產物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響見圖4。

GABA的初始濃度為0～20 mmol/L時，粗酶轉化液中的GABA逐漸增加，當GABA的濃度大于20 mmol/L時，轉化液中的GABA產量明顯下降，所以粗酶液轉化反應最適底物濃度為20 mmol/L。而P48細胞轉化組，當底物濃度大于或小于20 mmol/L時，其轉化液中的GABA的產量都下降，所以其最適產物濃度也為20 mmol/L。可見低濃度的產物有利于進行轉化反應。但是，當產物的量過高，反應體系達到飽和狀態，反應速度會減緩甚至可能出現停止的情況。通過對比發現，產物濃度在20～40 mmol/L時，轉化液中的GABA產量開始下降，但是細胞轉化反應組下降速度較緩慢。當體系的產物濃度逐漸增大，反應易出現反饋抑制。過多的產物分子可作為變構劑抑制GAD的活性，從而使得新生成的GABA含量減少。未加入GABA前，粗酶轉化液中的GABA含量比細胞菌懸液組要高，導致粗酶轉化反應受產物的抑制作用較大，而細胞轉化反應中由于細胞的保護作用使得轉化反應受產物濃度影響較小。由以上分析可知，P48菌懸液適合用于大規模生產GABA，轉化體系可以容納更高濃度的產物。

圖4 產物濃度對P48細胞轉化和粗酶轉化反應的影響

3 結論

采用植物乳桿菌P48細胞生物轉化制備GABA，試驗結果發現，細胞轉化反應的最適pH值為4.0，最適反應溫度45℃，加入的底物濃度100 mmol/L，加入的底物量較高，當產物濃度大于20 mmol/L時有產物抑制現象。試驗得到的P48細胞轉化條件，可在溫度較高條件下進行反應，有利于大規模生產時減少雜菌污染的影響；P48轉化反應能采用較高的起始底物濃度，有利用利于減少投料次數，降低生產成本，利于促進轉化反應的進行，增加GABA的產量。這為利用植物乳桿菌P48細胞大規模轉化制備GABA提供了實際的參考數據。