大腸桿菌形態變化規律的研究

烏 素，班 瑞，楊曉艷，李少英

（內蒙古農業大學食品科學與工程學院，內蒙古呼和浩特 010018）

大腸埃希氏菌（Escherichia coli，E.coli），又稱大腸桿菌，是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）、埃希氏菌屬 （Escherichia） 的代表菌。因Escherich在1885年發現而得名[1]，因其具有結構簡單、需要的營養物質簡單、易于培養、繁殖速度快、分布廣等特點，無論在科學試驗研究中，還是在食品安全和相關疾病研究中，常作為載體菌、指示菌、病原菌備受廣大科研工作者的關注[2]。如何快速檢測樣品中的大腸桿菌是研究者幾十年來一直亟待解決的問題，特別是大腸桿菌生長過程中的形態、染色特性等基本內容[1]。試驗通過革蘭氏染色的方法，對培養8～24 h大腸桿菌的形態特征進行研究，對今后更好地控制和利用大腸桿菌，具有指導意義和參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗菌株

標準菌株：Escherichia coli ATCC：25922（大腸桿菌），購于中國工業微生物菌種保藏管理中心，以下命名為E.coli-1。

試驗菌株：來自于實驗室保藏菌株，以下命名為E.coli-2。

1.1.2 試驗儀器與設備

KDC-140HR型高速冷凍離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司產品；CP522C型電子天平，奧豪斯儀器（上海）有限公司產品；WPL-230BE型電熱恒溫培養箱、BBS-SDC型潔凈工作臺，天津市泰斯特儀器有限公司產品；GR60DA型立式自動壓力蒸汽滅菌器，致微（廈門）儀器有限公司產品；DM500+ICC50Leica型顯微鏡，德國徠卡儀器有限公司產品。

1.1.3 試驗藥品

革蘭氏染色液，南京建成生物工程研究所提供；胰蛋白胨（生化試劑），國藥集團化學試劑有限公司提供；酵母提取粉（生化試劑），廣東環凱微生物科技有限公司提供；瓊脂（生化試劑），天津市英博生化試劑有限公司提供；氯化鈉（分析純），天津市風船化學試劑科技有限公司提供。

1.1.4 培養基的調配

①LB液體培養基的配制。胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，攪拌均勻，調pH值為7.4。②LB固體培養基的配制。將LB液體培養基調pH值后，再加入瓊脂15 g，加熱、攪拌至沸騰。將配置好的LB液體培養基分裝到試管中，固體培養基分裝到錐形瓶內，于121℃滅菌20 min[3]。

1.2 方法

1.2.1 菌株的活化與保藏

將大腸桿菌接種于LB液體培養基中，于37℃下恒溫培養24 h，如此再重復2次，穿刺保藏于LB半固體培養基中，37℃下恒溫培養24 h，于4℃保藏不同時間，備用。

1.2.2 不同生長階段形態的研究

分別對培養8～24 h的大腸桿菌進行涂片染色，中間每2 h涂1次片，觀察形態并記錄。

1.2.3 供試菌液制備

將保藏的大腸桿菌接種于LB液體培養基中，活化到三代，于37℃下恒溫培養24h，以轉速3000r/min離心10 min，棄去上清液，用生理鹽水洗滌（每次5 mL，反復離心洗滌3次），即得供試菌液[4]。

1.2.4 涂片的制備、干燥與固定

（1）涂片。采用傳統常規涂菌[4]。試驗將待觀察的大腸桿菌培養8～24 h，每隔2 h從37℃恒溫箱中取出1試管的菌液進行離心（以轉速3 000 r/min離心10 min），然后將離心好的菌泥在超凈臺中用接種環從離心管中挑起滿環或者半環進行涂片。

（2）干燥。將涂片放到滅菌的超凈臺中，于室溫下進行干燥[4]。

（3）固定。采用火焰固定法。

1.2.5 革蘭氏染色

初染（草酸銨結晶紫） 設定了1，2，3 min；媒染（革蘭氏碘液） 1 min；脫色（95%的乙醇） 設定了30 s和1，2，3 min；復染（番紅染色液） 1 min。步驟采用傳統染色法[5]。

2 結果與分析

2.1 不同培養時間大腸桿菌形態特征

將大腸桿菌活化2代，將第3代菌分別培養8，10，12，14，16，18，20，22，24 h，并分別對其進行標準革蘭氏染色，用油鏡（100×）進行觀察。

大腸桿菌E.coli-1，E.coli-2培養8～24 h的形態特征見表1。

由表1可知，經過標準的四步革蘭氏染色法對菌體進行涂片染色后，大腸桿菌都呈現紅色。其中培養8～16 h的大腸桿菌呈現短桿狀比較明顯，到了18～24 h大腸桿菌的形態變得無規則。這是因為細菌在適宜的培養條件下，一般十幾個小時即進入對數生長期。如果菌齡過長，菌體會出現異常形態[6]。

表1 大腸桿菌E.coli-1，E.coli-2培養8～24 h的形態特征

2.2 草酸銨結晶紫初染時間對大腸桿菌形態觀察的影響

用草酸銨結晶紫對培養16 h的大腸桿菌E.coli-1進行染色1～3 min，每種情況涂片10張。

草酸銨結晶紫染色1 min見圖1，草酸銨結晶紫染色2 min見圖2，草酸銨結晶紫染色3 min見圖3。

圖1 草酸銨結晶紫染色1 min

由圖1～圖3可知，草酸銨結晶紫對大腸桿菌染色1～3 min的染色效果是相同的，所以在染色時采用草酸銨結晶紫染色1 min，可以節省染色所消耗的時間。

2.3 酒精脫色時間對大腸桿菌形態觀察的影響

用培養16 h的大腸桿菌E.coli-1涂片分別進行1，2，3 min不同脫色時間試驗，每種情況涂片10張。

脫色1 min見圖4，脫色2 min見圖5，脫色3 min見圖6。

由圖4～圖6可知，由于涂片時涂菌厚度較一般涂片厚，因此在酒精脫色的過程中時間從30 s延長至1，2，3 min進行觀察后發現，酒精脫色3 min時觀察效果最佳，所以其余涂片染色時都把酒精脫色延長至3 min。同時應減少取菌量，降低細菌堆積密度，以防涂片菌膜濃厚時會因大腸桿菌密集成堆而不易脫色或脫色不完全，呈現假陽性反應[7-9]；而如果涂片太薄、大腸桿菌數量太少，觀察時難以尋找到合適視野[10]，所以涂片厚度也應該保持適中。

圖2 草酸銨結晶紫染色2 min

圖3 草酸銨結晶紫染色3 min

圖4 脫色1 min

圖5 脫色2 min

圖6 脫色3 min

2.4 番紅復染時間對大腸桿菌形態觀察的影響

用培養16 h的大腸桿菌E.coli-1涂片分別進行復染1，2，3 min試驗，每種情況涂片10張。

番紅染色1 min見圖7，番紅染色2 min見圖8，番紅染色3 min見圖9。

圖7 番紅染色1 min

圖8 番紅染色2 min

圖9 番紅染色3 min

由圖7～圖9可知，當番紅對大腸桿菌進行1～3 min染色時，其染色效果相同，所以在給大腸桿菌進行番紅染色時，選擇染色1 min，這樣既可以對大腸桿菌進行染色觀察，又縮短了對大腸桿菌的整體染色時間。

3 結論

大腸桿菌在培養8～16 h時，形態特征表現明顯，呈現短桿狀；到了18～24 h形態變得無規則。草酸銨結晶紫初染和番紅復染對革蘭氏染色結果影響較小，乙醇脫色時間對革蘭氏染色結果有較大影響，在對菌體染色過程中，應注意控制好菌齡和脫色時間[11-12]，才能得到正確的染色結果，以便于正確區分革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌，進而可幫助臨床對食物中毒原因及所用藥物做出正確選擇[5]。