茄褐紋病菌的分離鑒定及培養(yǎng)基篩選

馬珂

摘 ?要：對(duì)茄褐紋病菌的形態(tài)及適宜培養(yǎng)基類(lèi)型進(jìn)行了分析，在茄子的不同發(fā)病部位分離出α型、β型2種分生孢子;實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，燕麥培養(yǎng)基是最適宜褐紋病菌產(chǎn)孢的培養(yǎng)基，其次為PSA。

關(guān)鍵詞：茄褐紋病菌;分離鑒定;培養(yǎng)基;篩選

中圖分類(lèi)號(hào) S436.411文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）10-0074-03

褐紋?。≒homopsis vexans）是茄子重要的病害之一，主要危害茄子果實(shí)，影響果實(shí)的商品性。一般造成果腐發(fā)生率在20%～30%[1]，嚴(yán)重的高達(dá)80%[2，3]，茄子采種田因褐紋病的大發(fā)生而導(dǎo)致種子嚴(yán)重減產(chǎn)，甚至絕收。

茄褐紋病菌屬半知菌亞門(mén)球殼孢目擬莖點(diǎn)霉屬，病斑上產(chǎn)生的黑色分生孢子器初埋生于寄主表皮下，成熟后突破表皮而外露;孢子器單獨(dú)地生子座上，呈凸透鏡形，具有孔口，在自然狀態(tài)下，Phomopsis的分生孢子器多數(shù)僅含有α-型孢而無(wú)β-型孢，年佳續(xù)[4]綜合論述了擬莖點(diǎn)霉屬的檢測(cè)技術(shù)，認(rèn)為形態(tài)學(xué)鑒定的傳統(tǒng)方法仍是主要鑒定方法之一。羅利娟[5]對(duì)8種擬莖點(diǎn)霉在不同培養(yǎng)條件下的產(chǎn)孢情況進(jìn)行了研究，以其解決自然條件下擬莖點(diǎn)霉屬的鑒定問(wèn)題。陳永青、姜子德[6，7]分別用分子生物學(xué)的方法對(duì)多種擬莖點(diǎn)霉屬真菌進(jìn)行了系統(tǒng)研究，結(jié)果表明，Phoma與Phomopsis兩屬之間缺乏明顯的區(qū)分界限，在Phomopsis的分類(lèi)地位上仍存在著界限模糊的問(wèn)題。周永力[8]對(duì)Phomopsis的個(gè)體發(fā)育做了較為具體的闡述，主要涉及人工培養(yǎng)條件下的Phomopsis的產(chǎn)孢形式、孢子形態(tài)及菌落的生長(zhǎng)特點(diǎn)等方面。油球是Phomopsis屬的一個(gè)穩(wěn)定的特征，可作為該屬的判斷依據(jù)。溫度成為影響孢子類(lèi)型產(chǎn)生不同的主要因素，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，不同類(lèi)型的孢子形態(tài)的產(chǎn)生是與所發(fā)病的植株部位有關(guān)，在自然狀態(tài)下，Phomopsis的分生孢子器大多僅含有α-型孢而無(wú)β-型孢。本研究通過(guò)對(duì)采集樣本的徒手切片、鏡檢，以及篩選適宜培養(yǎng)基等方法，在較短時(shí)間內(nèi)用較為經(jīng)濟(jì)的手段，對(duì)茄褐紋病菌進(jìn)行準(zhǔn)確的初判，并對(duì)茄褐紋病菌的產(chǎn)孢條件進(jìn)行了進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 HA、HB采自安徽合肥，HY采自安徽和縣。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基。

1.2 儀器及試劑 光學(xué)顯微鏡，顯微攝像顯微鏡 （OLYMPUS），解剖刀，鑷子，剪刀，培養(yǎng)皿，載玻片，蓋玻片，恒溫箱。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 病原菌分離純化 采用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)組織分離法，于25℃培養(yǎng)純化，記錄菌落的形態(tài)和顏色，同時(shí)對(duì)病組織進(jìn)行徒手切片、鏡檢，觀測(cè)病原菌形態(tài)。并按柯赫氏法則[9]加以確認(rèn)，獲得茄褐紋病菌菌株3株，分別編號(hào)HA、HB、HY。

1.3.2 培養(yǎng)基篩選

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基的制備 （1）PSA培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，水1000mL;（2）PSA+VB1培養(yǎng)基：在原有PDA培養(yǎng)基成分中添加5mg維生素B1;（3）燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30g，瓊脂20g，水1000mL;（4）胡蘿卜培養(yǎng)基：200g胡蘿卜榨汁，25g瓊脂，水1000mL;（5）大豆培養(yǎng)基：干豆140g浸泡數(shù)小時(shí)后磨漿榨汁，瓊脂4g，水1000mL;（6）玉米培養(yǎng)基：玉米粉300g，瓊脂17g，水1000mL;（7）蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨5g，蔗糖10g瓊脂14g，水1000mL;（8）查彼培養(yǎng)基：蔗糖30g，硝酸鈉2g，氯化鉀0.5g，硫酸亞鐵0.01g，磷酸氫二鉀1g，硫酸鎂0.5g，瓊脂17g，水1000mL;（9）茄汁培養(yǎng)基：茄子200g榨汁，瓊脂25g，水1000mL。

1.3.2.2 菌絲生長(zhǎng)速率的測(cè)定 將茄褐紋病菌菌株HA、HB、HY分別在PDA斜面上活化3d，然后轉(zhuǎn)移至PSA平板上培養(yǎng)5d。在培養(yǎng)好的菌落平板上沿菌絲生長(zhǎng)邊緣用打孔器打直徑為6mm的小菌碟，分別移置不同培養(yǎng)基平板的中央，3次重復(fù)。25℃條件下恒溫培養(yǎng)，3d后按十字交叉法測(cè)量菌落的直徑，取平均值，測(cè)定生長(zhǎng)速率。

2 結(jié)果與分析

2.1 茄褐紋病病原的鑒定 茄褐紋病菌存在2種分生孢子：α型及β型分生孢子。α-型孢子為單孢，無(wú)色、長(zhǎng)圓柱形、球形、梭形，1端或2端較尖，有1～2個(gè)大油球或兩端各聚集多個(gè)小油球。β型呈細(xì)長(zhǎng)線狀，并在一端彎曲成鉤，兩者均為無(wú)色單胞。經(jīng)鏡檢得知，寄主發(fā)病部位不同，其分生孢子類(lèi)型有明顯差異：果實(shí)上分離的分生孢子有2種類(lèi)型，其中多數(shù)為α型分生孢子，伴有少量的β型分生孢子;從莖稈上的病斑采集到的都是β型分生孢子;葉片上的均為α型分生孢子。各部位分生孢子形態(tài)見(jiàn)圖1，分生孢子器形態(tài)見(jiàn)圖2。

2.2 培養(yǎng)基的篩選 3個(gè)褐紋病菌菌株在9種培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀及產(chǎn)孢情況結(jié)果見(jiàn)表1，菌株生長(zhǎng)情況結(jié)果見(jiàn)圖3。由表1可知，能夠產(chǎn)孢的培養(yǎng)基有PSA、燕麥、玉米、胡蘿卜，其產(chǎn)孢量依次為燕麥>PSA≥玉米>胡蘿卜，產(chǎn)孢時(shí)間除胡蘿卜培養(yǎng)基的時(shí)間在15d以上外，其他3種培養(yǎng)基的產(chǎn)孢時(shí)間都在10d以上。由圖3可知，菌絲生長(zhǎng)較好的培養(yǎng)基種類(lèi)有PSA、茄汁、玉米，不適合菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基為查彼和蛋白胨。3個(gè)菌株在不同的培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況存在差異，HA菌絲生長(zhǎng)最適的培養(yǎng)基為茄汁培養(yǎng)基，HB最適的為玉米培養(yǎng)基，HY最適的為PSA培養(yǎng)基。HB在9種培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況總體上優(yōu)于HY、HA，HA的菌絲生長(zhǎng)為最低，在產(chǎn)孢情況上，3個(gè)菌株的表現(xiàn)較為一致。

3 討論

茄褐紋病菌2種類(lèi)型的分生孢子（β型和α型）2端的油球，已經(jīng)成為Phpmopsis的分類(lèi)標(biāo)志。筆者在實(shí)驗(yàn)中觀察到，α型分生孢子的油球多數(shù)情況下保持在2個(gè)（1端1個(gè)），在極少數(shù)情況下，可以觀察到有3個(gè)油球存在。這一特征不僅是自然條件下形成的分生孢子，而且是人工條件下形成的分生孢子所共有的。而對(duì)于β型分生孢子，除在自然條件下較少見(jiàn)到外，因其不具有生殖能力，所以在一般人工培養(yǎng)條件下無(wú)β型分生孢子出現(xiàn)。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)茄褐紋病菌的分類(lèi)研究仍較少，因?qū)嶒?yàn)采集的菌株較少，研究存在著很大的局限性，有待于進(jìn)一步深入。