施用不同肥料對煙草土壤細菌群落的影響

張慧 李文卿 方宇

摘 ?要：利用Illumina平臺Miseq高通量測序技術對煙草根際土壤細菌進行高通量測序，結合相關生物信息學分析，探討了常規施肥、腐殖酸型有機無機復混肥、腐殖酸型生物有機肥和-N 20%腐殖酸型生物有機肥4種處理在煙草團棵期和采收期根際土壤細菌群落組成、多樣性和結構的變化。結果顯示，煙草根際土壤中細菌優勢門（相對豐度>10%）為變形菌門（Proteobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、酸桿菌門（Acidobacteria）;團棵期和采收期各處理的ACE指數和Chao1指數較CK均有所增加，說明施肥可以提高土壤細菌群落豐富性，其中采摘期施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥處理的ACE指數顯著高于CK;分層聚類圖在屬的水平上顯示，不同施肥處理的連作植煙土壤細菌群落存在較大差異，但這種差異不體現在結構多樣性上。Heatmap圖分析結果表明，土壤pH、有機質、養分等對煙草土壤細菌群落組成和多樣性存在影響。施用常規肥和-N 20%腐殖酸型生物有機肥對煙草土壤細菌優勢類群的相對豐度及群落結構的影響大于施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥，但施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥可以提高土壤細菌的多樣性。

關鍵詞：烤煙;腐殖酸型生物有機肥;高通量測序;土壤細菌群落

中圖分類號 S147.2 文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2019）10-0029-07

Abstract： This paper aimed to study the tobacco soil bacteria of different fertilizer application， the influence of structure and diversity， the deepening understanding of tobacco soil microbial groups and the community structure changes.The technology of high-throughput sequencing on Illumina MiSeq platform was adopted to investigate the effects of different fertilization on bacterial communities in tobacco rhizospheric soil. The 16S rDNA genes of

topsoil bacteria in tobacco rhizospheric soils were sequenced by high-throughput sequencing on Illumina MiSeq1 ?platform and related biological analysis conducted to investigate the changes in soil bacterial composition，diversity and structure under 4 different fertilization at resetting growth stage and picking period.Proteobacteria， Chloroflexi， Acidobacteria were the dominant phyla （with relative abundance>10%） in tobacco rhizospheric soils. The richness indexes （Chaol and ACE indexes） were higher for each treatment than for CK at resetting growth stage and picking period， showed that fertilization can improve soil bacterial community richness; The richness indexes （ACE indexes） were significantly higher for T2 and T3 than for CK in picking period， showed that application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve soil bacterial community richness. Hierarchical cluster analysis showed that different fertilizer treatments differ from that of continuous cropping plant tobacco soil bacterial community， but the difference is not reflected on the structural diversity. Heatmap figure analysis results show that the soil pH， organic matter and nutrient have correlation with tobacco soil bacterial community composition and diversity.The conventional fertilization and -N 20% humic acid biological organic fertilizer on tobacco soil bacteria dominant relative abundance and community structure is greater than the effect of applying humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer， but the application of humic acid type organic inorganic fertilizer and humic acid type biological organic fertilizer can improve the diversity of soil bacteria.

Key words： Flue-cured tobacco; Humic acid biological organic fertilizer; High-throughput sequencing; Bacterial community

煙草（Nicotiana tabacum）屬于茄科（Solanaceae）旱地作物。作為土壤肥力狀況的重要指標的土壤微生物，對其群落結構和功能的研究一直是熱點。煙草土壤微生物尤其是土壤細菌群落結構變化對煙草的品質有著重要的影響[1]。目前對煙草周圍環境微生物的研究主要集中在內生菌，探索其抗菌及促生作用[2-5]，對土壤微生物尤其是細菌群落結構的研究還為數不多。

傳統培養技術所獲得的可培養微生物只占土壤微生物總數的1%左右[6]，隨著科學技術的不斷進步，DGGE等傳統分子生物學方法的局限性日益凸顯。近年來，第2代高通量測序技術為土壤微生物等領域提供了支持，得到了廣泛應用[7]。

施用化肥及有機肥會對農田土壤微生物群落結構及多樣性產生一定的影響。由于肥料施用方式（施用量、長期施用或短期施用）、土壤類型和利用方式等因素的影響， 使得施肥對土壤微生物多樣性的影響非常復雜， 這一問題的相關報道結論不同，相關研究還有待進一步深入探討。筆者應用Illumina平臺的Miseq高通量測序煙草土壤細菌16s rDNA，研究了不同肥料的施用對煙草土壤細菌組成、結構及多樣性的影響，可以加深對煙草土壤微生物類群和群落結構變化的認識，為改良煙草肥料提供基礎理論支持，并為提高煙草產量及品質提供研究思路。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況 試驗在福建省三明市泰寧縣朱口鎮音山村（117°13′35′′E，26°56′51′′N），平均海拔300m，年平均氣溫為18.5℃，年日照時數1506h，全年無霜期為216～225d，年平均降雨量為1786mm。試驗地為水稻輪作的煙田，供試土壤類型為砂壤土，種植烤煙前耕層土壤（0～20cm）基本化學性質：pH5.9，有機質35g/kg，堿解氮174mg/kg，有效磷39.8mg/kg，速效鉀227mg/kg。供試烤煙品種為翠碧1號，由福建省煙草公司提供。烤煙大田株行距1.2m×0.5m，密度16675株/hm2，移栽時間2015年1月29日，6月上旬開始分批分部位采收。

1.2 試驗設計 設5個處理，即常規施肥（T1，956kg/hm2）、腐殖酸型有機無機復混肥（T2，1006kg/hm2）、腐殖酸型生物有機肥（T3，1210kg/hm2），以及-N20%腐殖酸型生物有機肥（T4，805kg/hm2），CK為不施肥。每個處理3次重復，隨機區組排列。T1中的肥料是煙草公司提供的煙草專用復合肥，成分比例為N：P2O5：K2O=10：7：21;T2腐殖酸型有機無機復混肥由貴州省貴福生態肥業有限公司提供，成分比例為N︰P2O5︰K2O=9.5︰6.3︰21.3;T3腐殖酸型生物有機肥來自貴州省貴福生態肥業有限公司，其有效菌種為枯芽孢桿菌（Bacillus subtilis），有效活菌數≥0.47億/g，N︰P2O5︰K2O=7.9︰6.1︰22。各處理所用肥料結合整地，于2015年1月18日移栽時作為基肥施入，基肥追肥比為3︰1，小區面積334m2，其余操作同常規優質烤煙栽培技術規范。

1.3 樣品采集 分別于團棵期和采收期取樣，每個小區“S”形多點取樣，在近煙株根部10cm處打土鉆（直徑3cm，深度15cm）作為1個耕層土壤樣品，充分混勻，重復3次，每份土樣分為2份，1份100g放入無菌袋中并迅速放入干冰盒中，帶回實驗室放入-80℃超低溫冰箱中保存，另1份約200g用來分析土壤化學性質。共得到5個處理不同時期土壤樣品30份，供高通量測序研究。

1.4 測定方法 土壤理化性質測定采用常規分析的方法[8]。使用MOBIO公司的試劑盒提取土壤DNA（PowerSoil? DNA Isolation Kit），按說明書操作，獲得純化的DNA后對細菌的16s rRNA基因V3～V4區進行高通量測序，委托上海美吉生物公司應用Illumina平臺的MiSeq進行。

1.5 數據分析方法 Miseq測序得到的是雙端序列數據，首先根據PE reads之間的overlap關系，將成對的reads拼接（merge）13成一條序列，同時對reads的質量和merge的效果進行質控過濾，根據序列首尾兩端的barcode和引物序列區分樣品得到有效序列，并校正序列方向。過濾read尾部質量值20以下的堿基，設置50bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50bp以下的read;根據PE reads之間的overlap關系，將成對reads拼接（merge）成1條序列，最小overlap長度為10bp;拼接序列的overlap區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列;根據序列首尾兩端的barcode和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。

對優化序列提取非重復序列，去除沒有重復的單序列。按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行OTU聚類，在聚類過程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列。將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。為了得到每個OTU對應的物種分類信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并分別在各個分類水平統計各樣本的群落組成。

1.6 土壤樣品測序、取樣深度驗證 由表1可知，通過對細菌16s rDNA的V3～V4區進行測序過濾，9個樣品獲得有效序列數在48889～57879，OTUs數在4392～5277，在97%相似水平下聚類為用于物種分類的OTU，統計得到各個樣品在不同OTU中的豐度信息。標準化后的序列數大于10000條，說明測序效果很好，滿足后續基因多樣性及豐度等功能分析。

表1 各樣品reads數及OTUs數

[處理 原始序列數 原始OTUs數 標準化后的序列數 標準化后的OTUs數 CK 54492 5277 42212 4112 RT1 48889 4510 42212 4341 RT2 57879 4803 42212 4225 RT3 50243 4563 42212 4306 RT4 52286 4392 42212 4183 PT1 48935 4514 42212 4325 PT2 56752 4581 42212 4400 PT3 54492 4515 42212 4343 PT4 52872 4456 42212 4128 ]

注：CK：移摘前土壤;T1：常規施肥;T2：腐殖酸型有機無機復混肥;T3：腐殖酸型生物有機肥;T4：-N20%腐殖酸型生物有機肥。R：團棵期;P：采收期。下同。

稀釋曲線[9]是從樣本中隨機抽取一定數量的個體，統計這些個體所代表的物種數目，并以個體數與物種數來構建曲線。它可以用來比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來說明樣本的測序數據量是否合理。采用對序列進行隨機抽樣的方法，以抽到的序列數與它們所能代表OTU的數目構建rarefaction curve，當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU。因此，通過作稀釋性曲線，可得出樣本的測序深度情況。試驗所有樣品在相似度0.97條件下的稀釋曲線如圖1所示，曲線趨向平坦，測序量均達到10000條以上，可以滿足分析要求。

2 結果與分析

2.1 各土壤樣品細菌群落的豐富度和多樣性 Chao1指數和ACE指數反映細菌群落豐富度，其值越高表明群落物種的豐富度越高[10-11];Shannon指數反映樣品的多樣性程度，其值越高表明群落物種的多樣性程度越高;Simpson指數反映了物種的優勢度[10-12]。由表2可以看出，物種覆蓋率為0.969～0.971，團棵期和采收期各處理的ACE指數和Chao1指數較CK均有所增加，說明施肥可以提高土壤細菌群落豐富性，其中采摘期處理2和處理3的ACE指數顯著高于CK，說明施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥有助于提高土壤細菌群落豐富度。Simpson指數和Shannon指數變化范圍都很小。試驗結果表明施肥處理對土壤細菌群落豐富度存在一定影響，且在煙草不同生育期表現存在差異。

2.2 不同施肥處理土壤細菌類群 為了直觀展示多樣品間OTUs情況，用在屬的水平相對豐度排名前50的細菌屬進行雙向二維聚類（圖2），通過顏色的梯度及相似程度來反映數據的相似性和差異性，可以清楚獲知樣本間發生的變化。由圖2可以看出，9個土壤樣品分成2大類，RT3單獨為一類，CK和其他處理為一類，其中同一時期的處理土壤樣品細菌群落結構較相似，團棵期3個處理相似度較高，采收期處理兩兩聚類，相似度高。說明不同時期處理所含OTUs含量和種類差異較大。

對所有土壤樣品測得的OTUs所對應的生物分類學信息進行統計表明，主要包括硝化螺旋菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、芽單孢菌門、變形菌門，這5個門在各樣品中所占比例均達4%以上，是植煙土壤中的優勢菌門，圖2中reads數前80的OTUs除以上5個菌門外，還分布于放線菌門。

在門的分類水平上，細菌分布在14個已知細菌門。如圖3和圖4所示，有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、芽單孢菌門（Gemmatimonadetes）、綠菌門（Chlorobi）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、厚壁菌門（Firmicutes）、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）、浮霉菌門（Planctomycetes）、Latescibacteria、Parcubacteria和Saccharibacteria14個細菌門，相對豐度之和在各個處理土壤樣品中均占到土壤細菌總量的95%以上。煙草CK和各處理在團棵期和采收期的優勢細菌門均為變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門。在團棵期，T1處理的變形菌門相對豐度減少3.6%，綠彎菌門和酸桿菌門分別增加6%和2.8%，T4處理的綠彎菌門相對豐度增加4%，T2和T3處理變形菌門的相對豐度分別增加2.3%和2.8%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少;采收期，T1處理的變形菌門相對豐度增加2.9%，綠彎菌門和酸桿菌門分別減少0.7%和2.1%，T4處理的變形菌門相對豐度增加3%，酸桿菌門減少1.6%，T2和T3處理變形菌門的相對豐度分別增加4.2%和2.6%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少，在生育期變化趨勢較一致。

通過Venn圖（圖5）分析了不同生育期土壤細菌共有的屬的數量及特有的屬，共有7210個屬，均有分布的屬有5290個：團棵期屬的種類最多，為6935個;CK處理中屬的種類最少，為5486個。CK中獨有的屬有21個，團棵期和成熟期分別有147個和229個。可見，使用肥料后隨著生育期的推進可增加特有物種。

2.3 不同施肥處理的主成分 主坐標軸PC1可解釋全部土壤樣品細菌群落豐度和多樣性方差的22.22%，主坐標軸PC2可解釋全部土壤樣品細菌群落的13.17%，兩者累計可解釋全部樣品的35.39%（圖6）[12]。樣品多樣性組成越相似，在PCA圖中代表樣品點間距離越近，CK和團棵期的各處理分散度較低，說明土壤樣品性質相似，成熟期各處理較分散，說明土壤樣品性質存在一定差異[13]。

2.4 不同施肥處理土壤細菌類群與土壤環境因子相關性 酸桿菌科的相對豐度與土壤pH呈正相關，經圖3和圖4分析常規施肥處理的酸桿菌門相對豐度增加2.8%，采收期減少2.1%，通過Heatmap圖分析可知，酸桿菌科的相對豐度與施肥造成土壤pH的變化相關（圖7）。叢毛單孢菌科、黃色桿菌科和芽單孢菌科同屬于變形菌門，分別與TP、TN、AK正相關，說明土壤中NP含量、K的利用程度與優勢菌門變形菌門的相對豐度變化相關。亞硝化單孢菌科與土壤pH呈負相關;浮霉菌科與TP負相關，黃單孢桿菌科與SOM呈正相關，與TN負相關;鞘酯菌科與TP、AP、AK均呈正相關。

3 結論與討論

長期有機無機肥配施能夠培肥地力[14]，而施用微生物菌肥可以將土壤微生態環境由紊亂復原到健康水平，從而起到防治土傳病害的作用[15]。土壤微生物多樣性相對比較穩定，長期合理施肥可以對土壤微生物群落結構和多樣性產生一定的影響[16]，但短期施肥對土壤微生物的影響不顯著[17]。本研究結果表明，不同施肥處理和不同生育期土壤細菌群落在結構上的差異不明顯，而細菌群落的相對豐度存在差異，說明施肥造成了某些細菌類群的富集或衰減，而沒有改變細菌群落種類，施肥等條件只影響了某些細菌種群的豐度。

植物根際細菌作為一類重要的微生物，與植物的生長發育有著密切的關系[19-21]。煙草種植土壤中細菌類群豐富，優勢細菌門有變形菌門、綠彎菌門、酸桿菌門，其中變形菌門的相對豐度最大，為29.2%～35.8%。施用不同肥料改變了煙草種植土壤的理化性質，因此對土壤中細菌優勢類群的相當豐度產生一定的影響。齊虹凌等[21]對不同菌群的相對豐度變化研究發現，細菌群落在烤煙生長的早期數量變化較大，而隨著生育期的推進細菌群落相對豐度變化不明顯。本研究中常規施肥的土壤在團棵期，變形菌門的相對豐度減少3.6%，采收期增加了2.9%;團棵期綠彎菌門和酸桿菌門分別增加6%和2.8%，采收期分別減少0.7%和2.1%，酸桿菌為嗜酸菌在土壤中分布廣泛，酸桿菌門的相對豐度在不同生育期的變化與施肥后土壤pH變化有關;施用減氮20%腐殖酸型生物有機肥的土壤，在團棵期綠彎菌門的相對豐度增加4%，采收期變形菌門相對豐度增加3%，酸桿菌門減少1.6%，這與王培雯等[22]土壤脲酶與土壤細菌群落豐度和多樣性均呈現反相關，單一的氮素水平增加不利于土壤細菌群落結構變化的研究結果基本一致。施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥的土壤變形菌門的相對豐度分別增加2.3%和2.8%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少;采收期，施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥的土壤變形菌門的相對豐度分別增加4.2%和2.6%，綠彎菌門和酸桿菌門略有減少，在生育期變化趨勢較一致。本研究中施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥在煙草不同生育期對土壤優勢菌門的相對豐度影響趨于穩定，說明這2種肥料對土壤細菌群落的影響是一個長期的相對穩定的變化過程，肥料中營養元素的配比對土壤細菌群落也有一定的影響。

Liu等[23-24]的研究表明土壤理化性質，尤其是土壤pH和土壤有機質對土壤細菌群落組成和多樣性有顯著影響。本研究中酸桿菌科的相對豐度與土壤pH呈正相關，這與不同生育期酸桿菌科的相對豐度和土壤pH的變化相吻合，由此可知酸桿菌科的相對豐度與施肥造成土壤pH的變化相關，印證了Liu等[23]的研究結果。變形菌門為細菌中最大的1個門，其中不乏土壤有益菌群，叢毛單孢菌科、黃色桿菌科和芽單孢菌科同屬于變形菌門，其相對豐度分別與土壤全氮、全磷、速效鉀呈正相關，說明優勢菌門變形菌門的相對豐度變化與土壤中全磷、速效鉀含量相關。亞硝化單孢菌科、芽單孢菌科的相對豐度與土壤pH呈負相關;浮霉菌科的相對豐度與全磷呈負相關，黃單孢桿菌科的相對豐度與土壤有機質呈正相關，與全氮呈負相關;鞘酯菌科的相對豐度與土壤全磷、速效磷、速效鉀均呈正相關。

施用不同肥料對煙草土壤細菌優勢類群的相對豐度及群落結構的影響不盡相同，施用常規施肥和-N20%腐殖酸型生物有機肥對煙草土壤細菌優勢類群的相對豐度及群落結構的影響大于施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥，施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥在煙草不同生育期對土壤優勢菌門的相對豐度影響趨于一致，但施用腐殖酸型有機無機復混肥和腐殖酸型生物有機肥可以提高土壤細菌的多樣性。

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（責編：徐世紅）