白芍多糖體內、外抗氧化活性組分篩選研究

秦亞東， 汪榮斌， 周娟娟

(1.安徽中醫(yī)藥高等專科學校 藥學系，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市中醫(yī)醫(yī)院 制劑室，安徽 蕪湖 241000)

人體的氧化與抗氧化作用應處于一個相對平衡狀態(tài)。由于種種原因產生過量的自由基和活性氧與人體的衰老、細胞的損傷等有密切關系，自由基過多會使細胞發(fā)生超氧化，引起細胞結構或功能的改變[1]，最終導致人體皮膚、內臟、大腦等組織器官衰老并引發(fā)多種嚴重疾病[2]。人體具有系統(tǒng)的抗氧化防御機制，可以最大限度的將體內的自由基和活性氧清除。其中酶系統(tǒng)抗氧化物包括身體自身的細胞內抗氧化酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷肽甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、過氧化氫酶(POD)等；非酶系統(tǒng)抗氧化物包括金屬結合蛋白、還原性谷胱甘肽(GSH)、各種維生素、激素等。

機體自由基的清除除依靠自身的抗氧化系統(tǒng)外，自然來源的藥物植物提取物也逐漸應用于抗氧化保健產品領域。研究表明植物中的多糖類物質具有明顯的生物活性, 是一種潛在的天然的抗氧化物質[3-5]。傳統(tǒng)中藥多糖抗氧化作用對預防和治療心腦血管系統(tǒng)疾病發(fā)揮重要作用，從傳統(tǒng)中藥多糖中尋求能夠清除體內自由基或能抑制機體氧化作用的活性組分或成分是中醫(yī)藥大健康行業(yè)發(fā)展的熱點領域。相關研究[6-7]已經證實白芍多糖在體內、外均具有一定的抗氧化作用[8]。為進一步探索白芍多糖體內、外抗化作用活性組分，本研究采用熱水回流提取后分步醇沉法，通過控制醇沉條件，將白芍多糖按分子量大小分為PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80四個組分，通過對四個組分的白芍多糖進行體內、外抗氧化活性組分篩選研究，明確白芍多糖抗氧化作用的活性多糖成分群所處組分，以期為白芍老藥新用及保健產品開發(fā)提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 試藥與試劑 白芍飲片購于安徽亳州中藥材大市場(批號：201607);抗壞血酸(VC),1,1-二苯代苦味肼基自由基(DPPH)購于國藥集團化學試劑有限公司；D-葡萄糖對照品購于中國食品藥品檢定研究院(批號：110833-201603)；維生素E(VE)膠丸購于廣州白云山制藥總廠(批號：2015021106)；無水乙醇，乙醚，丙酮等均為市售分析純；丙二醛(MDA，批號：20150211)，超氧化物歧化酶(SOD，批號：20150507)，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px, 批號：20150507)均購自于南京建成生物工程研究所。

1.1.2 受試動物 ICR小鼠，雄性，20±2 g，SPF級，購于南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，許可證號：SCXK(蘇)2017-0001，動物合格證號：NO.201711181。

1.1.3 儀器 RE-5002型旋轉蒸發(fā)儀(西安比諾儀器設備有限公司)；Cary60型紫外-可見分光光度儀(美國Agilent公司)；Sigma3-18K型臺式離心機(德國Sigma公司)；CAP124S型電子天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同組分白芍多糖的制備 在前期研究基礎，取白芍適量，粉碎后，經無水乙醇已經浸泡過夜處理2次，以除去小分子物質及色素等成分，藥渣自然晾干后熱水提取2次，合并濾液，水浴蒸發(fā)至原體積的三分之一，向濾液中緩慢加入無水乙醇使含醇量達到20%(v/v)，置冰水浴中12 h，收集下層沉淀，離心處理(3 000 r/min,5 min)，沉淀經丙酮、乙醚反復沖洗后，揮干溶劑即得PRPS20組分；繼續(xù)向上述濾液中加入無水乙醇使含醇量達到40%(v/v)，其余操作方法相同，以此類推，分別制得PRPS40組分、PRPS60組分、PRPS80組分。

1.2.2 多糖得率及多糖含量的測定 將1.2.1節(jié)下所得的PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80組分在60 ℃低溫干燥至恒重后稱定重量，分別計算各組分的多糖得率和多糖含量。多糖得率=不同組分多糖干燥后重量(g)/白芍取樣量(g)×100%；以D-葡萄糖為對照品，采用硫酸-苯酚顯色，紫外分光光度計于490 nm下測定[9]，計算白芍各組分多糖含量。

1.2.3 體外DPPH清除作用 參考文獻方法[5-7]，精密稱取白芍各組分多糖，以蒸餾水為溶劑，配制濃度為0.8 mg/mL溶液，然后梯度稀釋后分別得到濃度分別為0.8、0.4、0.20、0.10、0.05 mg/mL的多糖樣品溶液。分別取各樣品溶液與等體積的DPPH溶液加入同一具塞棕色試管中，震搖均勻后避光反應30 min，于517 nm下測定吸光度T，同時測定DPPH溶液與等體積純水混合液的吸光度C，以及待測液與等體積95%乙醇混合液的吸光度T0，清除率=[1-(T-T0)/C]×100%，本試驗采用抗壞血酸作為對照，同時計算半數清除率IC50。

1.2.4 體內抗氧化作用 受試小鼠隨機分為6 組：正常對照組、D-半乳糖模型組(100 mg/kg)、VE對照組(50 mg/kg)、白芍多糖PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80組(200 mg/kg)，每組10 只。白芍多糖組、VE對照組均使用0.3% CMC-Na配制成混懸液，10 mL/kg每天灌胃給藥1 次，正常組及D-半乳糖模型組給予等體積0.3% CMC-Na溶液灌胃給藥。除正常對照組外，其余各組每天頸背部皮下注射D-半乳糖(100 mg/kg)，注射劑量為0.01 mL/g，適應性飼養(yǎng)3 d后開始給藥，連續(xù)21 d。末次給藥后，禁食不禁水，16 h后取眼底靜脈血約1.0 mL收集與EP管中，靜置后低溫離心處理，取上層血清，按試劑盒操作說明，測定血清中MDA、SOD和GSH-Px活力。

2 結果與分析

2.1 白芍不同多糖組分得率及含量

分步醇沉對白芍多糖得率和含量的影響見圖1。醇沉濃度為20%時，多糖得率最高為1.69%，依次是40%和60%，最后當醇沉濃度為80%時多糖得率最低僅為0.67%，因此多糖得率有隨著醇沉濃度升高而下降的趨勢，同時也說明白芍多糖不同醇沉部分多糖的分布是不均勻的，20%和40%(高分子量多糖部分)醇沉部分占全部多糖的61%，80%醇沉部分(小分子量多糖)所占多糖比例較低為12.8%；各部分多糖含量的變化趨勢是先增加后降低，40%醇沉部分含量最高，80%多糖組分含量最低，可能與含有色素等小分子雜質有關。

圖1 分步醇沉對白芍多糖得率和含量的影響

2.2 體外清除DPPH作用

白芍多糖不同組分系列濃度對DPPH的清除作用呈現不同的規(guī)律，由圖2可見，PRPS20、PRPS40對DPPH的清除率隨濃度的增加無明顯變化；PRPS60、PRPS80隨著濃度的增加對DPPH的清除率逐漸增加，尤其是PRPS80組分更是顯示出了明顯的濃度依賴性。PRPS60、PRPS80和抗壞血酸的IC50分別為0.355、0.086、0.002 mg/mL，而抗壞血酸對照樣品在0.008 mg/mL時對DPPH的清除率達到50%。與抗壞血酸相比，白芍不同組分多糖對DPPH的清除能力較弱。

圖2 白芍多糖對DPPH清除作用

2.3 白芍多糖對衰老小鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px的影響

各組試驗小鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px活力測定結果見表1，由于中、低劑量組(100 mg/kg、50 mg/kg)對小鼠血清中SOD、MDA及GSH-Px活力影響不具統(tǒng)計學意義(P>0.05)，表1為高劑量組(200 mg/kg)試驗結果。D-半乳糖模型組小鼠血清中SOD、GSH-Px活力比正常對照組明顯降低，MDA活力明顯升高，均且具有統(tǒng)計學差異(P<0.01)，說明小鼠衰老造模成功；PRPS40組能顯著升高小鼠血清中SOD、GSH-Px活性，同時顯著降低MDA活性，具統(tǒng)計學差異(P<0.05或P<0.01)，其他多糖組作用不明顯。提示PRPS40組是白芍多糖體內發(fā)揮抗氧化作用的物質基礎，可能是白芍多糖體內抗氧化的活性多糖組分。

表1 PRPS對衰老小鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px的影響

注：與正常對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，△P<0.05,△△P<0.01。

3 結論與討論

隨著對中藥多糖研究的不斷深入，越來越多的中藥多糖被證實具有多方面的生物學活性。傳統(tǒng)中藥多糖具有復雜的化學結構，因此中藥多糖均一成分的提取分離難度較大。為降低白芍多糖體內外抗氧化活性組分的研究難度，結合課題組前期研究確定白芍多糖在體內、外均具有一定的抗氧化作用[6-7]，為尋求白芍多糖抗氧化藥效物質基礎，本研究利用分步醇沉手段，通過控制醇沉濃度，將白芍多糖按分子量大小分為PRPS20、PRPS40、PRPS60、PRPS80四個組分，通過對4個分子量范圍不同的白芍多糖組分進行體內、外抗氧化作用比較，以確定白芍多糖抗氧化活性組分。

本研究利用經典體外抗氧化作用試驗DPPH自由基清除率測定試驗，由于其穩(wěn)定性高、結果重現性好，且在同一測試條件下結果具有極大的可比性。由研究結果可見白芍多糖4個組分在體外抗氧化活性總體效果較弱，如圖2所示。PRPS80和PRPS60在試驗所用濃度范圍內尚呈現一定的濃度依賴性，尤其是PRPS80可以說是白芍多糖體外抗氧化的活性組分，但和抗壞血酸相比，其抗氧化作用較弱(PRPS80組分的IC50為0.086 mg/mL，抗壞血酸的IC50為0.008 mg/mL)。白芍多糖體外抗氧化作用雖然較弱，但不能代表白芍多糖在體內抗氧化的真實情況，任何體外抗氧化的化學模式都不可能完全模擬體內真實生理環(huán)境下的抗氧化作用。白芍多糖體內抗氧化作用結果提示PRPS40組分高劑量組(預試驗表明200 mg/kg作用明顯，中低劑量組(50、100 mg/kg)效果不顯著，P>0.05)在對抗衰老小鼠試驗中表現出了一定的抗氧化作用，PRPS40組分多糖可以升高SOD、GSH-Px活力，降低MDA水平，體現出了明顯的體內抗氧化作用，而其他3個組分作用則不明顯，提示PRPS40組分是白芍多糖是體內抗氧化作用的物質基礎，是起到體內抗氧化的活性多糖組分[10]。PRPS40組分仍不是分子量均一的多糖化學成分，課題組將進一步對PRPS40組分進行分離純化，繼續(xù)尋求分子量均一的多糖化學成分，并對其進行結構表征和生物學活性的深入研究。通過本試驗研究，以期為多糖抗氧化活性成分的深入研究提供思路和借鑒。