長鏈非編碼RNA ERVH48-1在膀胱癌中的表達及對膀胱癌細胞增殖和遷移的影響

楊金輝 胡海龍 孫建濤 郝彤彤 李小輝 張 寒

膀胱癌是泌尿系統最常見的惡性腫瘤，其發生率呈逐年上升趨勢，然而其確切的發病機制尚不明確[1]。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是長度大于200個nt的不具有編碼蛋白功能的RNA，具有組織特異性[2]。lncRNA參與調控細胞的增殖、分化、凋亡等方面有關，近年的研究成果表明lncRNA與多種惡性腫瘤的形成密切相關[3]。越來越多的lncRNA被發現與膀胱癌的發生、發展、轉移等密切相關[4]。ERVH48-1是一個全新的lncRNA，在疾病特別是腫瘤中少有報道。本研究通過檢測ERVH48-1在膀胱癌組織和細胞株中的表達水平，觀察ERVH48-1與膀胱癌發生、發展的相關性。選取表達水平最低的膀胱癌細胞，向細胞株內轉染ERVH48-1質粒，觀察細胞株增殖、遷移和下游基因表達的改變，探討ERVH48-1對膀胱癌細胞生物學行為的影響和可能的作用機制。

材料與方法

1.材料:選取筆者醫院泌尿外科2017年2月～2017年11月收治的膀胱癌患者16例，所有患者術前均未接受過化學治療、放射治療、生物免疫治療，所有組織標本均經病理證實，本研究經筆者醫院倫理學委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。膀胱癌細胞(BIU87、T24、5637、UM-UC-3)和正常膀胱上皮細胞(SV-HUC-1)購自中國科學院上海細胞庫。LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司。長鏈非編碼RNA ERVH48-1 質粒和陰性對照質粒購自上海吉瑪制藥技術有限公司。DMEM高糖培養基、RPMI 1640培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司。Transwell小室購自美國康寧公司。熒光定量 PCR 試劑盒和噻唑藍(methyl thiazol tetrazolium，MTT)試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。一抗TCF21、CDK4、CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin和α-Tubulin購自美國Cell Signaling Technology公司。ECL顯影液購自美國Thermo公司。辣根過氧化物酶標記的二抗購自武漢博士德生物有限公司。

2.細胞培養與轉染:在37℃、5%CO2的培養箱內，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的RPMI-1640培養基培養膀胱癌細胞BIU87、T24和5637，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基培養膀胱癌細胞UM-UC-3和正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1。在轉染前1天，將5637細胞使用不含雙抗的培養基重懸后接種到6孔板中，當細胞融合度達到60%時，根據LipofectamineTM3000轉染試劑說明書進行轉染，分別轉染ERVH48-1質粒(實驗組)和陰性對照質粒(對照組)，lncRNA的終濃度為15nmol/L。18h后吸去培養基，加入新鮮培養基繼續培養。

3.熒光實時定量PCR檢測 ERVH48-1、TCF21 mRNA的表達量:采用TRIzol法提取組織和細胞的總RNA，檢測RNA濃度和純度，反轉錄為cDNA。以GAPDH為內參，采用熒光定量PCR試劑盒檢測組織和細胞中ERVH48-1或TCF21 mRNA 的表達水平。反應條件為：94℃ 10min、60℃ 1min、72℃ 1min，35個循環。實時定量PCR引物序列詳見表1，每個樣品設置4個復孔，檢測得到的熒光信號值采用2-ΔΔCt方法進行統計分析。

表1 實時定量PCR引物序列

4.MTT法檢測高表達ERVH48-1對5637細胞增殖能力的影響:實驗組細胞轉染ERVH48-1質粒，對照組細胞轉染陰性對照質粒，24h后收集細胞，調整細胞密度重鋪至96孔板(4000個/孔)，每組設置4個復孔，在培養箱內連續培養5天。在每天的檢測時間點，每孔分別加入20μl MTT試劑，在培養箱內孵育4h后，吸凈孔內培養基，每孔加入100μl二甲基亞砜，96孔板在搖床上振蕩15min，在酶聯免疫檢測儀上檢測各孔在490nm波長處的吸光度(A)值，繪制生長曲線。

5.Transwell實驗檢測高表達ERVH48-1對5637細胞遷移能力的影響:轉染48h后消化收集各組5637細胞，使用無血清培養基重懸細胞，細胞計數并調整細胞濃度至2×105/ml，取200μl細胞懸液加入上室，下室內加入600μl含10%胎牛血清的培養基，培養箱內連續培養18h后。使用PBS溶液清洗Transwell小室，使用95%甲醇固定20min，使用0.3%結晶紫染液染色20min，使用PBS溶液清洗，使用棉簽擦去未穿過濾膜的細胞。顯微鏡計數穿過濾膜的細胞，以4個視野的細胞平均數為準。

6.Western blot法檢測高表達ERVH48-1對5637細胞相關蛋白表達的影響:轉染48h后消化收集各組5637細胞，使用PBS溶液洗滌細胞，提取總蛋白。蛋白樣品經10%SDS-PAGE跑膠后轉膜電至PVDF膜上。各組蛋白樣品經SDS-PAGE電泳后，電轉至PVDF膜，室溫下使用含5%牛血清白蛋白的封閉液封閉3h，4℃下分別與一抗TCF21、CDK4、CDK6、Cyclin D1、N-cadherin、Vimentin和α-Tubulin孵育過夜，洗膜后室溫下與二抗孵育3h，洗膜后滴加ECL顯影液顯影。

結 果

1.膀胱癌組織和癌旁組織中ERVH48-1的表達量:膀胱癌組織和癌旁組織中ERVH48-1的表達量分別為1.65±0.23和5.41±0.40，膀胱癌組織中ERVH48-1表達量明顯低于癌旁組織(P<0.01，圖1)。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中ERVH48-1表達水平檢測與癌旁組織比較，*P<0.01

2.膀胱癌細胞和正常膀胱上皮細胞中ERVH48-1的表達量：與SV-HUC-1正常膀胱上皮細胞比較，膀胱癌細胞中的ERVH48-1表達量明顯降低，膀胱癌細胞BIU87、T24、5637、UM-UC-3和正常膀胱上皮細胞SV-HUC-1中ERVH48-1的表達量分別為0.60±0.04、0.36±0.04、0.17±0.03、0.78±0.02和1.01±0.07，膀胱癌細胞株中ERVH48-1表達量均低于正常膀胱上皮細胞(P<0.05)。其中5637細胞中ERVH48-1的表達水平最低(P<0.01，圖2)。

圖2 正常膀胱上皮細胞和膀胱癌細胞中ERVH48-1表達水平檢測與SV-HUC-1細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.各組5637細胞中ERVH48-1的表達量:轉染48h后收集各組5637細胞，對照組和實驗組5637細胞中ERVH48-1表達量分別為1.01±0.06和6.27±0.44，實驗組明顯高于對照組(P<0.01)，ERVH48-1質粒使細胞中ERVH48-1的表達明顯增加(圖3)。

圖3 實驗組和對照組5637細胞中ERVH48-1的表達量與對照組比較，*P<0.01

4.高表達ERVH48-1抑制5637細胞的增殖能力：通過MTT法連續5天檢測各組5637細胞的增殖能力，以時間(天)為橫軸、吸光度(A)值為縱軸繪制生長曲線。與對照組比較，從第3天起，實驗組細胞增殖能力明顯受到抑制(P<0.05，圖4)。

圖4 MTT檢測各組膀胱癌細胞增殖能力與對照組比較，*P<0.05

5.高表達ERVH48-1抑制5637細胞的遷移能力：Transwell實驗檢測各組5637細胞的遷移能力。實驗組和對照組5637細胞穿過濾膜細胞數分別為69.74 ± 17.95和192.20 ± 27.56，表明ERVH48-1能夠抑制5637細胞的遷移能力，差異有統計學意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Transwell實驗檢測ERVH48-1對膀胱癌細胞遷移能力的影響與對照組比較，*P<0.01

6.高表達ERVH48-1促進膀胱癌5637細胞中TCF21 mRNA的表達:熒光實時定量PCR檢測各組5637細胞TCF21 mRNA的表達水平，結果顯示，實驗組和對照組5637細胞TCF21 mRNA的表達分別為9.97±0.74和1.01±0.06， ERVH48-1能夠促進TCF21 mRNA的表達(P<0.01)。

7.高表達ERVH48-1對膀胱癌5637細胞下游蛋白表達的影響:Western blot法檢測各組5637細胞下游蛋白的表達，結果顯示高表達ERVH48-1誘導TCF21蛋白表達升高，TCF21蛋白表達升高引起細胞增殖相關蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1表達明顯降低，細胞遷移相關蛋白N-cadherin、Vimentin表達明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測ERVH48-1下游蛋白表達水平

討 論

長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，廣泛分布于真核細胞的細胞質和細胞核內[5]。lncRNA可在轉錄后水平通過多種方式如加帽、加尾、選擇性剪接促進或抑制下游基因的表達[6]。近年來研究表明，大量lncRNA在正常組織和腫瘤組織中存在異常的差異性表達，lncRNA在腫瘤的發生、發展過程中可能起著抑癌作用[7]。膀胱癌的發生、發展過程中受到很多lncRNA的調控，MALAT1、XIST可促進膀胱癌細胞的增殖和轉移，HULC、DUXAP10、SNHG16可促進膀胱癌細胞的增殖[8～12]。目前有關長鏈非編碼RNA ERVH48-1在腫瘤中的作用未見報道。

本研究通過檢測ERVH48-1在膀胱癌組織和膀胱癌細胞株中的表達水平，發現ERVH48-1在膀胱癌組織和膀胱癌細胞株中表達水平下調，提示ERVH48-1可能在膀胱癌中發揮類似抑癌基因的作用。本研究通過轉染實驗證明了高表達ERVH48-1能夠抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移，說明ERVH48-1可能通過抑制增殖和遷移調控膀胱癌的形成，這對于揭示膀胱癌的發生、發展機制具有重要意義。轉錄因子21(TCF21)基因定位于6q23-q24，是一種新發現的抑癌基因[13]。TCF21在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、腎癌等中表達明顯下調，可顯著抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力，且與患者的低生存率明顯相關[14～16]。有研究顯示，TCF21在膀胱癌中的表達水平明顯降低[17]。本研究發現，高表達膀胱癌細胞中ERVH48-1的表達后，TCF21基因在mRNA和蛋白的表達水平明顯升高。TCF21蛋白表達升高后，細胞增殖相關蛋白CDK4、CDK6、Cyclin D1表達明顯降低，細胞遷移相關蛋白N-cadherin、Vimentin表達明顯降低，與細胞功能實驗結果一致。長鏈非編碼RNA ERVH48-1調控TCF21基因的分子機制和信號通路是本研究下一步研究的重點。

綜上所述，長鏈非編碼RNA ERVH48-1在膀胱癌中低表達。高表達ERVH48-1可明顯抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移，其作用機制可能通過促進抑癌基因TCF21的表達。ERVH48-1可能為膀胱癌的診治提供新的治療靶標和分子標志物。