PCBP1對6-OHDA作用的HA細胞生長狀況的影響

賈冰冰 葉 夢 霍麗蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在神經退行性疾病中流行趨勢位居第二，表現為肌肉僵直、運動遲緩、肌強直和靜止性震顫[1，2]。PD的特征在于紋狀體區黑質致密部的多巴胺能神經元進行性壞死和缺失，雖然通過使用左旋多巴、多巴胺脫羧酶抑制劑、多巴胺激動劑和深部腦刺激等方法，臨床癥狀可以得到一定改善，但此類方法未能阻止神經元變性死亡[3～5]。PCBP1含有3個KH同源域。在哺乳動物中，PCBP1可通過KH同源域識別并結合含多聚胞嘧啶的DNA和RNA序列。PCBP1在細胞質和細胞核中均可表達，但主要定位于細胞核。PCBP1基因可被翻譯為具有多功能、多聚胞嘧啶特性的核酸結合蛋白。PCBP1通過與多聚胞嘧啶結合的特性在基因表達中起著重要作用，如mRNA穩定、RNA剪切、特殊基因的轉錄調控等[6，7]。本研究通過將pEGFP/N-PCBP1重組質粒轉染HA細胞，再加入神經毒素6-OHDA后，探討PCBP1基因的過表達對人星形膠質細胞生長狀況的影響。

材料與方法

1.材料和試劑：人星形膠質細胞由首都醫科大學附屬北京天壇醫院神經外科研究所惠贈。各種細胞培養基購自美國Gibicol公司；臺盼藍購自北京索萊寶生物科技有限公司。CCK-8試劑盒、卡那霉素、限制性內切酶EcoRⅠ、感受態細胞制備試劑盒、質粒提取試劑盒購自上海生物工程有限公司。LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司。pEGFP/N-PCBP1重組質粒為筆者研究室保存。

2.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1擴增與鑒定：以含PCBP1的重組質粒為模板進行聚合酶鏈式反應(PCR)對目的基因PCBP1進行擴增，上游引物：5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′，下游引物:5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAG-CTGCACC-3′，目的片段包含PCBP1的起始子及終止子并含有EcoRⅠ酶切位點。將PCR擴增片段用EcoR Ⅰ酶切，進一步純化后，進行瓊脂糖凝膠電泳；將超低溫冰箱中取出的感受態細胞置冰上融化，每100μl感受態細胞中加入100pg～10ng待轉化質粒，輕柔混勻，于冰上靜置30min，將離心管置42℃水浴鍋中孵育60s，取出后立即冰上放置2～3min，取適量菌液涂布至卡那霉素抗性的LB平板中，于37℃培養箱中培養過夜。孵育后挑取單個細菌菌落，于含抗生素的液體培養基中，放置在37℃水平搖床上進行擴增12～16h。收集菌液進行質粒提取，將提取質粒以EcoRⅠ酶切，純化后進行DNA測序，明確重組質粒的準確性。

3.HA的培養和轉染：人源星形膠質細胞系HA細胞用含10%FBS,1%青霉素-鏈霉素混合的培養基，置于37℃，5% CO2細胞培養箱中常規培養，隔天更換培養基。細胞達到90%融合時，1%PBS洗滌兩遍，用0.125%的胰酶消化，傳代。轉染前1天，取對數生長期細胞，經PBS洗滌和胰酶消化后，按照104個/毫升濃度接種到6孔板中，在細胞鋪滿皿底時，將細胞上清液棄掉，更換為不含雙抗的細胞培養基，繼續培養8h后，用LipofectamineTM2000轉染試劑對HA細胞進行轉染，取3μg的pEGFP/N1-PCBP1或pEGFP/N1質粒與250ml的opti-MEM混勻，且將10μl的脂質體與250ml的opti-MEM混勻，室溫孵育5min后分別將兩種質粒與脂質體進行混勻，室溫靜置20min,再將混合液逐滴加入細胞培養基中，邊滴加邊晃動培養皿。轉染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP-N1可發綠色熒光。

4.CCK-8法檢測PCBP1對6-OHDA作用的HA細胞生長狀況的影響：將處于對數生長期的細胞按5×103個接種于96孔細胞培養板中，每孔100μl培養基。將細胞分為pEGFP/N1-PCBP1(實驗組)和pEGFP/N1(對照組)，按照上述方法進行轉染。轉染24h時分別將5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組中，每個樣本重復5次。繼續培養48h后，每孔加10μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃培養箱孵育3h后，應用酶聯免疫儀檢測于波長450nm處測定吸光度(A)值。

5.細胞計數法檢測：將對數生長期細胞按2×104個接種到12孔培養板中，每孔1.5ml培養基，分別對實驗組和對照組細胞進行轉染，轉染24h時將5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到實驗組和對照組中，設3個復孔。繼續培養48h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞密度。同時，將各組細胞經胰酶消化后，制備細胞懸液，經臺盼藍染色后，進行細胞計數。

結 果

1.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1的鑒定：重組質粒pEGFP/N1-PCBP1經酶切，純化后進行DNA測序及瓊脂糖凝膠電泳，PCBP1基因插入位點及所編碼序列正確(圖1)。

圖1 DNA測序分析重組質粒pEGFP/N1-PCBP1箭頭所指為PCBP1基因插入質粒的相應位點

2.質粒轉染HA細胞:用對照質粒 pEGFP/N1和重組pEGFP/N1-PCBP1分別對HA細胞進行轉染，轉染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1發出綠色熒光(圖2)。

圖2 倒置熒光顯微鏡分析質粒在BV-2細胞中的表達(×20)A.對空載質粒pEGFP/N1在HA細胞中的表達；B.重組質粒pEGFP/N1-PCBP1在HA細胞中的表達

3.PCBP1對6-OHDA作用的HA細胞生長變化的影響：將HA細胞種植于12孔板中，轉染后24h，將不同濃度的6-OHDA滴加到實驗組和對照組細胞中，繼續培養3天開始進行細胞計數和CCK-8法檢測細胞A值。細胞計數法和CCK-8法顯示,5、10μmol/L 6-OHDA作用下，實驗組細胞較對照組增殖加速，差異有統計學意義(P<0.05)。20、30μmol/L 6-OHDA作用下，實驗組和對照組的細胞增殖情況比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖3、圖4)。

圖3 細胞計數法檢測PCBP1轉染后對HA細胞增殖的影響與pEGFP/N1組比較，*P<0.05

4.HA細胞轉染PCBP1后的生長現象:如圖5所示，在5、10μmol/L的6-OHDA作用下，轉染PCBP1的HA細胞明顯達到80%的匯片率；而20、30μmol/L的6-OHDA作用下，轉染PCBP1的HA細胞與對照組細胞的生長狀況比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

圖4 CCK-8法檢測PCBP1轉染后對HA細胞增殖的影響與pEGFP/N1組比較，*P<0.05

圖5 PCBP1轉染后促進細胞生長現象(×20)A.5μmol/L 6-OHDA；B.10μmol/L 6-OHDA；C.20μmol/L 6-OHDA；D.30μmol/L 6-OHDA。1.對照組細胞生長狀況；2.實驗組細胞生長狀況

討 論

PCBP1在神經系統疾病中的作用逐漸成為目前研究的熱點[8]。PCBP1主要通過與多聚胞嘧啶的結合發揮重要生物學作用[9]。PCBP1含有兩種核定位信號序列(nuclear localization signal,NLS)，NLS可調節蛋白由細胞質到細胞核的轉運。PCBP1可作為特殊基因的轉錄調控子，參與環境信號轉錄應答的調節。PCBP1主要參與pre-mRNA的編輯和選擇性剪切、mRNA出核和翻譯調控等[10,11]。現已發現一種最為嚴重的核纖層疾病——早老綜合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)，與PCBP1可能密切相關，此研究證明在早老綜合征細胞中可見Lamin A聚集在核內膜，PCBP1可與Lamin A/C結合又可作為Progerin的相互作用伙伴。PCBP1用于調節早老綜合征細胞中的各種RNAs和蛋白質的表達仍有待進一步研究。由此看來，PCBP1可能與細胞的復制分化過程有關，此功能的干預可關系到早老綜合征的病理進程[12]。小熱休克蛋白(the small heat shock protein,HSPB1)突變可導致嚴重的周圍神經系統疾病[13,14]。Geuens等[15]研究發現，PCBP1可與HSPB1-P182L突變蛋白特異性結合，而導致其翻譯抑制活性的降低。通過RNA免疫沉淀法對小鼠大腦RNA測序顯示PCBP1 mRNA為HSPB1-P182L突變蛋白作用靶點，且這些靶點由大量的 3′-和5′-UTRs以及豐富的CTCCTCCTCCTCC共有序列組成。因此，在神經退行性疾病中，HSPB1可與PCBP1相互作用降低翻譯抑制性。

本研究將PCBP1重組質粒轉染SH-SY5Y細胞，通過熒光顯微鏡觀察，PCBP1主要在神經元細胞系SH-SY5Y細胞的胞質和核膜中廣泛表達，且細胞生長速度明顯增加[16]。在本研究中，重點關注PCBP1對神經系統中星形膠質細胞的作用，在神經毒素6-OHDA作用下，PCBP1對星形膠質細胞的生長情況有何影響。實驗中通過CCK-8法和細胞計數法證明，與對照組比較，在低濃度的6-OHDA作用下，轉染PCBP1重組基因的HA細胞生長明顯加劇。推測可能是由于6-OHDA進入細胞內后激起氧化活性物質(ROS)、超氧化物(H2O2)等產生，進而導致細胞不可逆性死亡[17]。然而，神經細胞壞死的嚴重程度與6-OHDA的濃度有明顯關系[18，19]。本研究初步證明了PCBP1對神經毒素有一定的抗性作用，且在星形膠質細胞生長和發育中起重要作用。