液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯用法測定中藥口服液中7種指標性成分

房 康, 郭項雨, 王宏偉, 熊行創, 白 樺, 雷海民, 馬 強*(.中國檢驗檢疫科學研究院,北京 0076;2.北京中醫藥大學中藥學院,北京 02488;.中國計量科學研究院,北京 00029)

中藥是我國傳統醫學的重要組成部分,是防治疾病的重要工具。據不完全統計,目前全球有130多個國家和地區銷售中藥,世界上近四分之一的人口使用中藥。中藥制劑以中醫藥理論為指導,以中藥為原料,根據處方將其制成某種劑型供臨床直接使用,以達到最大限度地發揮藥物療效的目的。中藥活性成分是保證臨床療效的關鍵,其質量控制尤為重要。建立中藥制劑指標成分的分析檢測方法可為中藥制劑質量控制提供保障,同時也是中藥現代化、國際化的關鍵[1]。目前色譜技術被廣泛應用于中藥制劑產品中丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等重要指標成分和有效活性物質的分離分析[2],已見報道的方法包括薄層色譜法[3]、氣相色譜法[4]、毛細管電泳法[5],高效/超高效液相色譜法[6]、生物色譜法[7]、超臨界流體色譜法[8]等。

離子遷移譜(ion mobility spectrometry,IMS)是一種利用大氣壓下電離形成的氣相離子在電場中遷移速率的差異對化學物質進行分離和表征的分析技術,已被廣泛應用于毒品檢測[9]、公共安全[10,11]、食品及化妝品安全[12-16]、環境監測[17,18]、藥品檢測[19-23]、生命科學[24]等相關領域。離子遷移譜的基本原理是,待測樣品在電離反應區進行電離,產生的離子在電場力驅動下,通過周期性開啟的離子門進入漂移區,與逆向的中性漂移氣體分子不斷發生碰撞,使具有不同遷移率的離子得到分離并依次到達檢測電極[25,26]。在離子遷移譜測量中,首先要生成氣相離子,然后才能進行產物離子的分離和檢測。離子遷移譜現有的離子化方式包括放射性離子化、電暈放電離子化、光致離子化、火焰離子化、電噴霧離子化等[27]。其中,電噴霧電離源的出現,進一步拓展了離子遷移譜的應用范圍,可用于分析熱不穩定和難揮發性化合物。特別是電噴霧電離-離子遷移譜技術已有用于中藥分析領域的研究報道[28-32]。

盡管離子遷移譜具有簡單便攜、成本低廉、快速靈敏等優點,但分離能力有限,在樣品基質較為復雜的情況下,可能存在無法滿足多組分同時分離需求、離子化過程中不同物質間產生電離競爭抑制等問題。將離子遷移譜與液相色譜通過電噴霧接口聯用,離子遷移譜作為液相色譜的檢測器,彌補了液相色譜常用的紫外檢測器靈敏度低、對于分子結構上缺少生色基團的化合物沒有信號響應的弊端。通過測量色譜分離柱流出物得到的離子遷移譜圖,從而同時實現電噴霧電離前、基于疏水性差異和電噴霧電離后、基于離子遷移率不同的二維分離,可為復雜樣品體系的準確鑒定提供更為豐富的化學信息,增強離子遷移譜的分析價值。液相色譜-離子遷移譜聯用技術目前已應用于天然產物[33]、藥物小分子或中間體[34,35]、碳水化合物[36]、多肽[37]和蛋白質[38]的分離分析。液相色譜-離子遷移譜聯用在硬件設備上較之液相色譜-質譜聯用儀,具有價格成本優勢,適合現場快速檢測。同時,離子遷移譜是在常壓下對氣態離子進行分析而非質譜儀所需的高真空條件,液相色譜與離子遷移譜聯用的接口裝置簡單、易于搭建實現。

本文采用液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯用技術,建立了中藥口服液中丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種代表性指標成分的分析方法,并優化了液相色譜、噴霧電壓、遷移管和氣體預加熱溫度、漂移氣流速等分析參數,同時建立了指標性成分的液相色譜-三重四極桿質譜輔助確證方法,為中藥制劑質量控制和活性成分檢測提供了科學有效的技術手段。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

GA2100型便攜式離子遷移譜儀(美國Excellims公司),配有電噴霧離子源、離子柵門控制器、空氣過濾裝置(含硫酸鈣和分子篩)、高分辨率離子遷移分析器、法拉第杯檢測器、VisIon儀器控制與數據處理系統,使用前用色氨酸和檸檬酸分別在正、負離子模式下校正儀器;QuickSplit 600-PO10-04型可調節式分流器(美國Analytical Scientific Instruments公司);ACQUITY超高效液相色譜儀、Xevo TQ-MS三重四極桿質譜儀、MassLynx數據處理系統(美國Waters公司);Milli-Q Integral 5型超純水器(美國Merck Millipore公司)。丹參素(CAS 22681-72-7,純度98%)和綠原酸(CAS 327-97-9,純度98%)購自北京中科質檢生物技術有限公司;甘草酸(CAS 1405-86-3,純度98%)、蘆丁(CAS 153-18-4,純度98%)、黃芩苷(CAS 21967-41-9,純度98%)和天麻素(CAS 62499-27-8,純度98%)購自百靈威科技有限公司;葛根素(CAS 3681-99-0,純度98%)購自中國食品藥品檢定研究院。7種標準物質用甲醇配制成1 g/L標準儲備液,使用時根據需要用甲醇稀釋成混合標準工作液;甲醇(色譜純)購自美國Fisher公司;色氨酸和檸檬酸購自美國Sigma-Aldrich公司,以甲醇配成10 mg/L校正液進行儀器校正。

1.2 實驗方法

實驗室自行搭建的液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯用實驗裝置示意圖如圖1所示。樣品溶液經液相色譜分離后導入可調節式分流器(設置分流比為50∶1),流出液分為兩路:一路與離子遷移譜儀連接(1 μL/min),在噴霧電壓作用下發生電噴霧離子化,形成的離子進入離子遷移譜的遷移管內進行分離,最終到達法拉第杯檢測器,檢測得到相應測試圖譜;另一路流出液進入三重四極桿質譜儀,在多反應監測(MRM)模式下采集7種待測物的信號,可對離子遷移譜檢測結果作進一步確證。

圖1 液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜實驗流程Fig.1 Schematic of the liquid chromatography-electrospray ionization-ion mobility spectrometry work flow

表1 7種待測物的分子式、相對分子質量、離子化方式和遷移時間Table 1 Formulae,relative molecular masses (Mr), ionization modes and drift times of the seven analytes

1.3 液相色譜分離條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×1 mm,1.7 μm);流速:50 μL/min;流動相A為0.5%(v/v)甲酸水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～3 min,5%B～10%B;3～10 min,10%B～80%B;10～12 min,80%B;12～12.1 min,80%B～5%B;12.1～15 min,5%B;柱溫:25 ℃;樣品室溫度:20 ℃;進樣量:5 μL。

1.4 離子遷移譜分析條件

電噴霧電壓:2 400 V;離子化模式:負離子模式;遷移管電壓:8 000 V;遷移管溫度:190 ℃;氣體預加熱溫度:190 ℃;遷移譜寬:26 ms;Bradbury-Nielsen離子門脈沖寬度:110 μs，電壓:37 V;漂移氣流速:1.4 L/min;排氣泵抽速:1.0 L/min。7種待測物的分子式、相對分子質量和遷移時間見表1,離子遷移譜圖見圖2。

1.5 質譜分析條件

電噴霧離子源負離子模式;毛細管電壓:2.8 kV;射頻透鏡電壓:0.3 kV;離子源溫度:150 ℃;脫溶劑氣溫度:500 ℃;脫溶劑氣流量:800 L/h;錐孔氣流量:50 L/h;光電倍增器電壓:650 V;碰撞氣:氬氣;碰撞氣壓:0.32 Pa。7種待測物的質譜分析參數見表2,多反應監測色譜圖見圖3。

圖2 7種待測物的離子遷移譜圖Fig.2 Ion mobility spectra of the seven analytes

圖3 7種待測物的多反應監測色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of the seven analytes

表2 7種待測物的質譜參數Table 2 MS parameters of the seven analytes

* Ions with higher responses.

2 結果與討論

2.1 液相色譜分離條件的優化

離子遷移譜在與液相色譜聯用時,電噴霧電離源是最為常用的接口方式,通過高壓電場產生帶電液滴和待測物離子,而后進入離子遷移譜檢測。由于本實驗中離子遷移譜配備的電噴霧接口沒有內置的輔助氣和加熱模塊,因此能夠耐受的流速范圍較低。綜合考慮適用流速、分離效率、色譜峰形以及與電噴霧接口兼容性等因素,本研究選用了微徑柱ACQUITY UPLC BEH C18(50 mm×1 mm,1.7 μm)。經比較,以乙腈作為流動相的有機溶劑可獲得較好的色譜性能和信號響應。鑒于7種待測物均為酸性化合物,經考察,以0.5%(v/v)甲酸水溶液作為流動相水相可獲得理想的色譜峰形和保留行為。

2.2 離子遷移譜噴霧電壓的優化

噴霧電壓是決定目標成分信號響應強度及離子化效果的重要參數。樣品經液相色譜分離,柱后流出液經分流器分流后,在噴霧電壓作用下產生離子,進入離子遷移譜,得到響應信號。本實驗考察噴霧電壓為1 600～2 600 V條件下,7種中藥指標成分的響應值。它們的最佳噴霧電壓略有差異,實驗結果如圖4所示。綜合考慮7種待測化合物各自的最佳噴霧電壓值及離子化效果,確定本方法的噴霧電壓為2 400 V。

2.3 離子遷移譜遷移管和氣體預加熱溫度的優化

本研究考察了離子遷移譜遷移管和氣體預加熱溫度對目標化合物信號強度的影響。為避免由于熱交換或其他因素而導致的離子遷移時間重現性差、響應值不穩定等問題[39],實驗在優化上述兩項參數時將其設為相同值。溫度過低時,環境中水分子會對離子信號造成干擾;溫度過高會造成系統不穩定,導致離子損失。分別考察了不同溫度(160、170、180、190、200 ℃)對7種中藥指標成分響應值的影響,結果如圖5所示。綜合考慮各目標化合物離子的信號強度、信號漂移時間的穩定性以及峰形,選擇190 ℃為遷移管和氣體預加熱溫度。

2.4 離子遷移譜漂移氣流速的優化

漂移氣的種類和流速對離子分辨率和響應強度存在一定的影響[40]。空氣憑借穩定性強、成本低廉等優勢被選用為漂移氣。本研究考察了不同漂移氣流速(1.2～2.2 L/min)對7種化合物分離效果和響應強度的影響,實驗結果見圖6。當漂移氣流速過低時,7種化合物的分辨率較差;而流速太高時,響應信號的強度降低,原因可能是目標物被稀釋,電場力的作用被抵消,離子難以到達檢測器。經考察,漂移氣的最佳流速為1.4 L/min。

圖4 不同噴霧電壓下7種待測物的信號響應(n=3)Fig.4 Signal responses of the seven analytes at various spray voltages (n=3)

圖5 不同遷移管及氣體預加熱溫度下7種待測物的信號響應(n=3)Fig.5 Signal responses of the seven analytes at various drift tube and gas pre-heating temperatures (n=3)

圖6 不同漂移氣流速下7種待測物的信號響應(n=3)Fig.6 Signal responses of the seven analytes at various drift gas velocities (n=3)

2.5 液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯用分析

在分別對液相色譜和離子遷移譜條件進行優化的基礎上,將液相色譜通過電噴霧離子源與離子遷移譜聯用,進行二維分離分析,結果見圖7。丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁可同時實現電噴霧電離前、基于疏水性差異和電噴霧電離后、基于離子遷移率不同的二維分離,因此每種成分分別具有各自的色譜保留時間和離子遷移譜遷移時間,用于識別確認。丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種中藥指標性成分的檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關系數見表3。

表3 7種待測物的線性方程、線性范圍、相關系數(r)、檢出限和定量限Table 3 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r),limits of detection (LODs)and limits of quantitation (LOQs)of the seven analytes

y:peak area;x:mass concentration,μg/mL.

由于常規液相色譜柱的工作流速通常在mL/min數量級,而電噴霧離子遷移譜能夠耐受的流速范圍較低,通常在μL/min級別,二者之間并不匹配。離子遷移譜配備的電噴霧離子源沒有專門的脫溶劑氣和加熱模塊,過高的進樣流速會造成離子化效率降低,離子遷移譜信號噪聲增加。利用色譜柱后分流技術可以得到較低流速,以適應電噴霧離子遷移譜的兼容要求。為了盡可能降低設置分流比所導致的樣品流失,本研究采用了內徑為1 mm的微徑色譜柱,其適宜的工作流速約為50 μL/min。但推測由于在色譜柱后分流過程中,經過分流器流向離子遷移譜的溶液流速由分流器前的50 μL/min降低至約1 μL/min,流速的驟降導致管路內壓力的大幅降低,進而導致管路內成分譜帶在一定程度上發生擴散、峰形擴展,且各譜帶有同步趨同的趨勢。而經過分流器流向質譜的溶液流速為49 μL/min,較之分流器前的流速幾乎維持不變,也幾乎不會造成壓力的波動,因此譜帶分布總體上延續原有狀態。

2.6 液相色譜-三重四極桿質譜分析確證

本研究還開發了丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種指標性成分的液相色譜-三重四極桿質譜確證方法。每種目標化合物分別選擇一個前體離子和對應的兩個產物離子作為監測離子對,7種待測成分的質譜分析參數見表2。如果樣品中目標化合物的離子相對豐度與濃度相當的標準溶液的相對豐度一致,且偏差不超過表2中對應的允許偏差,則判斷樣品中含有相應的目標化合物。

2.7 樣品測定

應用本方法對兒感退熱寧口服液、清開靈口服液、小兒清肺化痰口服液、小兒七星茶口服液、雙黃連口服液等5件中藥口服液實際樣品進行了檢測分析。經測定,上述中藥口服液樣品中,指標性成分甘草酸的含量為730.69和841.82 μg/mL,黃芩苷的含量分別為4.22、6.51和13.08 mg/mL,均達到了《中華人民共和國藥典》2015版中的含量要求。

3 結論

本研究采用液相色譜-電噴霧電離-離子遷移譜聯用技術,利用離子遷移譜高分辨、快速分離以及與液相色譜分離之間具有正交性的特點,建立了中藥口服液中丹參素、甘草酸、天麻素、綠原酸、葛根素、黃芩苷、蘆丁等7種指標性成分的分離分析方法。液相色譜和離子遷移譜分別基于目標化合物的疏水性和離子遷移率差異進行分離,由此組成的二維分離體系在分離能力上可相互補充,提高樣品分離分析效率,可為復雜樣品體系的全面解析提供更為豐富的綜合信息。在后續實驗研究中,將探索采用微升/納升液相色譜與離子遷移譜聯用的相關研究。