美拉德反應產物類黑精的研究進展

韓 易,趙 燕,徐明生,姚 瑤,吳 娜,杜華英,涂勇剛,*

(1.江西農業大學食品科學與工程學院,江西省天然產物與功能食品重點實驗室,江西南昌 330045; 2.南昌大學,生物質轉化教育部工程研究中心,江西南昌 330047)

美拉德反應是由法國生物化學家美拉德于1912年發現的一種非酶褐變反應,又稱羰氨反應。在此反應中,羰基化合物(還原糖類)與氨基化合物(氨基酸、肽、蛋白質、胺等)經過縮合、聚合后最終生成一類棕褐色、結構復雜、聚合度不等的高分子聚合物混合物,稱之為類黑精[1]。美拉德反應過程復雜,其終產物類黑精結構也極其復雜,并具有多種功能活性。

類黑精廣泛地存在于各類食品中,如蜂蜜、食醋、醬油、咖啡、烤面包、皮蛋、豆豉和醬油等,是食品色澤和風味的主要來源,同時具有一定的功能活性。因此,自發現以來,類黑精成為食品學、營養學、香料化學、毒理學以及中藥學研究中經久不衰的研究課題。基于類黑精在食品中的重要性,本文對美拉德反應產物類黑精的制備、分離純化、理化特性與結構表征以及功能活性展開綜述,以期為食品類黑精的相關研究及應用開發提供參考。

1 類黑精的形成

類黑精的形成經歷了美拉德反應的三個階段,分別為初期階段、中期階段與末期階段。其每一個階段包括若干反應。初期階段發生了羰氨縮合與分子重排兩種作用,生成了Schiff堿與單果糖胺及酮糖基胺等異構體;中期階段果糖基胺脫水生成羥甲基糠醛,果糖基胺脫去胺殘基重排生成還原酮,同時伴有Strecker降解產生二氧化碳,果糖基胺還會生成其他雜環化合物如吡咯,呋喃吡喃化合物等;末期階段多羰基不飽和化合物一方面進行裂解反應,另一方面進行縮合聚合反應,如醇醛縮合生成不飽和醛,或是前階段產物中的糠醛及其衍生物、二羰基化合物、還原酮類和裂解的醛等物質,經過進一步縮合聚合形成復雜的高分子色素類黑精。類黑精具體形成的過程如圖1所示,其是以葡萄糖做糖源為例的美拉德反應生成類黑精的具體路線。

圖1 美拉德反應形成類黑精的路線圖Fig.1 Reaction route for the formation of melanoidins in Maillard reaction

2 類黑精的來源與制備

類黑精廣泛存在于食品中,早餐谷類食品中類黑精含量較高達到25.5%,餅干達到20.2%;同種食品不同部位類黑精含量也不盡相同,面包皮中類黑精含量高達14.0%,而整個面包中其含量低至4.4%,同類食品不同特性情況下類黑精含量也有所差別,咖啡類黑精含量為5.7%±2.3%,而速溶咖啡其含量稍高一些,為9.1%±3.7%,可能速溶咖啡中的類黑精溶解量更大,液態食品例如淺色啤酒也含有類黑精達8.7%[2]。類黑精也可以通過不同氨基酸與還原糖制備獲得。由于類黑精形成過程復雜,目前使用單一氨基酸及還原糖模型制備類黑精的研究較多。Mondaca-Navarro等[3]分別使用半胱氨酸、甘氨酸、異亮氨酸、賴氨酸、果糖、葡萄糖為原料,其中氨基酸與葡萄糖按照1∶1 (v/v)的比例在不同溫度、不同時間下進行美拉德反應,測定了獲得的不同種模型的類黑精抗氧化性以及金屬離子螯合作用。Vhangani等[4]使用核糖、果糖、甘氨酸、賴氨酸為美拉德反應原料制備了類黑精,并測定了其抗氧化性能。總之,使用單一氨基酸與單一還原糖造模進行美拉德反應,形成類黑精結構相對簡單,性質較為穩定,更適合后續研究,是目前開展此類研究的熱點。

3 類黑精提取及分離純化方法

3.1 類黑精的提取

提取類黑精的主要方法為溶劑提取法,所選用提取劑大多為水或不同濃度的乙醇水溶液。秦禮康[5]在粗提豆豉類黑精過程中,用不同濃度的乙醇水溶液對樣品進行振蕩溶解,以吸光值作為衡量指標,優化出最佳提取劑的料液比為1∶10。蔣家奎[6]采用不同濃度乙醇水溶液多次浸提鎮江香醋炒米,從中提取類黑精。雖然操作簡單,但是此種溶劑提取方法只能提取水溶性或醇溶性類黑精,被提取的類黑精種類并不全面,會對類黑精之后的分離純化、結構分析、理化性質研究及生物活性機理等的開展帶來一定影響。

3.2 類黑精的分離純化

目前應用的類黑精分離純化方法有凝膠柱層析法、超濾法、透析法、硅膠柱層析法、大孔樹脂分離法和高效液相色譜法,其應用對象與優缺點見表1。雖然上述方法在類黑精分離上得到較好應用,但由于食品中類黑精的組成復雜多樣,同時其作為一類隨時間和溫度不斷縮合和裂解的物質,類黑精的單體分離純化具有難度,類黑精單體難以獲得較好的分離純化,經過分離純化后得到不同分離組分的類黑精成為了目前的研究熱點。

表1 類黑精分離純化方法的對比Table 1 Comparisons between separation and purification methods of melanoidin

4 類黑精的理化性質及結構表征

類黑精是一類高分子量聚合物,較難從食物中分離得到其單體,因此對其理化性質及結構研究并不是十分詳盡。但通過類黑精美拉德反應模型反應體系研究,得出了類黑精的部分共同理化特性與結構特征。

4.1 溶解性

類黑精具有較好的溶解特性,原因可能是發生美拉德反應后蛋白間二硫鍵的鏈接和異構肽之間的交聯、及蛋白分子與親水的糖基的鏈接等因素降低了蛋白質相互作用,從而增強了蛋白質的溶解性。Saeki等[16]發現魚肌纖維蛋白與葡萄糖發生美拉德反應后,溶解性有所提高;而Katamama等[17]選用扇貝肌纖維蛋白與葡萄糖進行美拉德反應,同樣反應物具有良好的溶解特性;Shepherd等[18]發現酪蛋白-麥芽糊精的美拉德反應產物類黑精在低于pH6.0條件下均具有很好的溶解性,而未發生美拉德反應的對照組在pH4.8以下幾乎不溶。此外,Groubet等[19]通過對β酪蛋白在厭氧條件下發生美拉德反應的研究發現,在缺少氧氣的條件下,反應產物類黑精溶解性提高并不明顯,原因是在美拉德反應初期階段分子重排過程中形成的Amadori化合物很少,而導致反應末期的蛋白質交聯,使最終生成類黑精的速率較低[20]。總之,經過美拉德反應后生成類黑精產物的溶解性與反應前相比有所提高。

4.2 熱穩定性

類黑精具有較好的穩定特性。Shu等[21]研究了天然溶菌酶及其經過美拉德反應修飾后的熱穩定性,結果表明隨著溫度的升高,天然溶菌酶的濁度逐漸增加,在85 ℃下有所轉變,在95 ℃下達到了最大的濁度,而溶菌酶-半乳甘露聚糖類黑精,即使在95 ℃下也未出現聚集,這說明溶菌酶通過半乳甘露聚糖的美拉德修飾轉化為受熱穩定的形式。因此,多糖的鏈接可能引起蛋白形成受熱穩定的結構。

4.3 光譜特性

4.3.1 紫外光譜特性 類黑精在紫外光譜中有特殊吸收峰,其大多表示為芳香族氨基酸吸收峰。Jiang等[22]對乳清蛋白-核糖類黑精紫外光譜研究顯示,類黑精在214～220 nm和275～278 nm處有吸收峰,前者特征峰主要表征肽鍵的變化,后者主要由類黑精生成過程中的生色團結構如呋喃、吡喃、吡咯等化合物形成引起。另外在220和280 nm處最大吸收峰也表明薜夫堿(-RC=N-)的形成[23]。

4.3.2 紅外光譜特性 傅里葉紅外光譜是研究美拉德反應產物類黑精的有效手段。Sun等[24]研究了羧甲基纖維素(CMC)和大豆分離蛋白(SPI)發生美拉德反應過程中1700～1400 cm-1處紅外光譜吸收峰的變化,結果表明酰胺I帶的C=O伸縮振動(1680～1630 cm-1)和N-H彎曲振動(1655～1590 cm-1)吸收強度略有減弱,這種減少是由美拉德反應中羰基、氨基含量減少逐漸聚合形成大分子物質產生的,但由于美拉德反應初級產物Amadori化合物,薛夫堿及吡嗪的形成,會在此處有一定吸收,所以造成該處吸收峰變化不明顯。酰胺III帶(1450～1240 cm-1)這一區間主要來自于C-N的伸縮和N-H的變化。Rhim等[25]研究表明，酰胺III帶的變化是由于芳香族結構中C-H向平面外彎曲而產生的。上述紅外光譜現象表明生成類黑精會導致蛋白光譜中基團吸收發生變化,因此可以推測出具有代表性的類黑精基團,為類黑精復雜結構提供了基礎研究。

4.3.3 熒光光譜特性 類黑精在激發波長340～370 nm、發射波長為420～440 nm下具有典型的熒光波普特征,并且與未發生美拉德反應的物質對比,在420～440 nm處有新峰生成[26]。Baisier等[27]認為這些熒光物質主要來源于生成類黑精過程中氨基化合物的Strecker降解,或由中間產物中活性還原性化合物的進一步反應形成。

4.4 高分子量物質

類黑精是含氮的高分子量物質[28],其組分中同時也含有少量低分子物質[29]。高分子量的類黑精顏色比低分子量深。Brudzynski等[30]研究發現蜂蜜隨著溫度的增加褐變度增加,主要歸因于高分子量的黑色素存在。咖啡中59%組分為高分子類黑精(>12～14 kDa),并且高分子組分的生成主要是因為咖啡長時間焙燒的原因,并且其顯示出比低分子組分的類黑精更強烈的棕色色感[31]。對于美拉德模型反應生成類黑精的分子量也有相關研究,在天冬酰胺-葡萄糖模型系統中反應加熱超過24 h所產生的類黑精分子量大部分大于10 kDa[32]。由此可見,美拉德反應產物顏色的形成主要來自于高分子量類黑精。

4.5 負電性結構

雖然類黑精化學組成多種多樣,但研究表明類黑精均以負電荷的形式存在于食品或者是美拉德反應模型體系中。咖啡中類黑精是一種聚合高分子陰離子物質[33],在咖啡類黑精中高分子量類黑精比低分子量類黑精帶有更多的負電荷。由模型反應制備的類黑精同樣具有負電荷性質。Kwak等[34]使用毛細管電泳技術將葡萄糖和賴氨酸反應生成的類黑精進行分離分析,結果表明其等電點的范圍是3.5～4.85,說明在偏酸性的條件下,此模型中類黑精解離的正、負離子的趨勢和程度相同,所以在水溶情況下pH為中性時其帶有負電荷性質。因此,食物中提取的類黑精以及模型制造的類黑精都具有負電性的結構特征。

4.6 單元結構特征

由此可見,類黑精復雜結構目前尚無定論,但研究表明類黑精的結構主要包括重復單元的吡咯或呋喃組成的聚合物等,通過縮聚反應最終形成美拉德反應產物。同時,類黑精根據分子量可分為兩部分[39]，一類是低分子量有色物質,分子量小于1 kDa,另一類是高分子量有色物質,分子量大于1 kDa,有些高達100 kDa,這些高分子量物質是由低分子量的生色團通過氨基酸的氨基與蛋白質交聯而形成的。類黑精也可能主要是由美拉德反應第一階段的降解產物通過縮合聚合而形成的物質,糖分骨架占有大部分,氨基酸側鏈可能是后連上的。

5 生物活性

類黑精已被證實具有抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗炎、降糖、降血壓等多種生物活性,表2列舉了來自各類食物及模型的類黑精所具有的生物學功能。

表2 各類食物及模型體系中類黑精的生物學功能Table 2 Biological activities of melanoidins from various food and model systems

5.1 抗氧化作用

食品中提取的類黑精或由美拉德反應模型體系產生的類黑精在體內、體外均具有較好的抗氧化作用。食醋類黑精[8]在不同的抗氧化體系(DPPH自由基體系、超氧陰離子自由體系、羥自由基的體系、還原力)中均表現出抗氧化性。闞建全等[7]通過對豆豉類黑精測定過氧化值與紫外光解值證明其同時具有消除羥自由基,抗氧化和抑制N-二甲基亞硝胺的合成作用,其中對羥自由基消除能力高達95.79%,1%的豆豉類黑精的抗氧化能力相當于0.2% BHT,在pH4時對抑制亞硝胺合成具有很強的作用,表明豆豉類黑精在模擬胃液的情況下抑制其生成。有研究者認為類黑精具有抗氧化性是因為其具有金屬螯合能力[40],類黑精的負電荷性質使得其能夠螯合過渡金屬。另外,類黑精的強抗氧化性可能是因為由美拉德反應產生的低分子量類黑精化合物具有較好的自由基清除能力[41]。此外,研究發現過氧化氫和ABTS自由基的清除能力和類黑精顏色有具有良好的線性相關性[7]。面包提取物中非酚醛類成分的清除自由基能力隨烘烤時間的延長而增加,醋類黑精清除羥自由基的活性在蒸煮、儲藏和老化階段逐漸增加[8]。食品和模擬體系中類黑精生成量逐漸增加,同時抗氧化性也隨之增加,說明類黑精的抗氧化能力與其顏色反應程度呈正相關性。雖然類黑精是被公認的抗氧化劑,但是對其抗氧化機理的研究還有待進一步探索。

5.2 抗腫瘤作用

類黑精對肺癌、腸癌胃癌等均有一定抑制作用。Langner等[42]研究表明熱加工后的馬鈴薯類黑精提取物可防止肺癌細胞增殖,而且對正常細胞無毒性作用,具有潛在的飲食癌癥預防劑應用前景。類黑精可以抑制人腸道癌細胞增殖,推測可能是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)受到類黑精抑制,使腸道癌細胞的細胞周期、細胞微管組織受影響而引起細胞凋亡[43]。Kamei等[44]發現從日本豆面醬和醬油中提取分離出的類黑精可以抑制DNA的合成與分化過程,從而證明其可以有效抑制體外結腸癌和胃癌細胞生長。類黑精體外抗腫瘤特性的研究較多,需要進一步深入研究其體內抗腫瘤效果與作用機制。

5.3 抗菌與抗炎作用

反應模型制備的類黑精與食品中提取的類黑精均具有較好抗菌特性[45]。研究表明類黑精具有螯合性,可以捕獲陽離子,縮短或消除致病性菌的生長與繁殖[46],對慢性胃病發生發展中的幽門螺桿菌也具有抑制作用[47]。Marko等[48]表明與經常用于治療傳染病的抗生素(阿米卡星、環丙沙星、亞胺培南和左旋氟沙星)相比,美拉德反應初始階段產物Schiff堿環化后的氮代葡萄糖基胺以及終產物類黑精中部分的氨基還原酮,不僅顯示出較高的抑制微生物作用,并可與上述抗生素產生協同效應。類黑精的抑菌活性不僅僅作用于胃腸道,Daglia等[49]研究表明咖啡經過焙烤之后產生的活性物質,可以吸附到主體牙齒表面,防止牙齒受體與變異鏈球菌粘附,從而防止齲齒。

除抗菌活性外,類黑精也可同時具有較好的抗炎作用。Helou等[50]研究了面包外殼棕色美拉德反應產物在人類腸道中的作用,結果表明面包類黑精對于人胃腸道腸桿菌具有抑制作用,微生物群對其有反依賴性;而且,面包類黑精通過抑制腸桿菌而呈現一定抗炎功效。Vitaglione等[51]認為咖啡類黑精可調節肝臟炎癥相關蛋白質和細胞因子的表達,從而起到保護由高脂肪飲食引起肝臟損傷的作用。

5.4 降血壓作用

食品中類黑精基本骨架中氨基分支里含有糖降解產物,他們對血管緊張素轉換酶(ACE)具有一定抑制作用[52]。經過研究發現咖啡中類黑精具有抑制ACE的作用,具有降血壓的功效,抑制活性位點可能位于類黑精結構中,但也部分歸因于非化學結合在類黑精結構上的低分子量化合物,即類黑精可作為血壓保護劑的載體[53]。五明紀春等[10]發現醬油類黑精對ACE具有較好抑制作用,促使血管緊張素Ⅱ生成及緩激肽降解減少,血管擴張,血壓降低。但是類黑精抑制ACE的作用機制尚不明確,推測部分低分子量成分的類黑精可作為競爭性抑制劑,從而競爭底物酶的活性中心。

類黑精生物活性種類多樣,但是各種活性的機理尚不明確,對于體內實驗需進一步摸索探究,其構效關系還不清楚,活性機制與功效關系研究薄弱嚴重限制了類黑精的開發應用。

6 展望

美拉德反應產物類黑精,不但對食品色澤和風味品質有重大影響,而且具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、降糖等多種生物活性功效,是近年來國內外食品營養學、食品化學領域的研究焦點之一,具有成為新型功能食品的潛力,但到目前為止,關于美拉德反應產物類黑精的具體組成、結構和性質等仍不十分清楚,且其作用機制尚待進一步研究,現提出以下展望:

建立類黑精高效的分離純化方法。目前,類黑精分離純化的方法有限,主要采用透析、超濾、層析、色譜或毛細管電泳等方法進行分離純化。此分離策略操作條件復雜、效率低、成本高,并且難以獲得類黑精單體。因此,有必要建立高效的類黑精分離純化方式,這是對其結構與構效關系的關鍵。

闡明類黑精結構及其生物活性機制。類黑精結構研究較為單薄,僅有獲得的類黑精單元結構信息，但也屬理論推論。因此,在有效分離類黑精的基礎上,應借助各種現代高分子儀器分析手段,闡明其精細結構。同時,從體內外系統研究其活性機制,探明其構效關系,為其應用提供理論基礎。

進一步開發利用類黑精產品。雖然已證實類黑精具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、抗菌、抗炎等多種生理活性,但目前市場上并未見其相關功能性食品。因此,有必要開發不同類型的類黑精產品,使其成為一種新型功能食品或者食品添加劑替代品,從而為人類健康起到一定積極作用。