超聲波輔助酶法提取葡萄皮渣多酚工藝優化

陳瑞喜,王璐璐,+,陳德蓉,雷芳萍,楊學山,2,祝 霞,2,*

(1.甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070; 2.甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室,甘肅蘭州 730070)

甘肅省河西走廊葡萄酒產區因其得天獨厚的地理條件(北緯36～40°),非常適合釀酒葡萄的栽培,釀酒葡萄種植面積超過30萬畝,年產量達2.41萬噸[1]。與此同時,釀酒后葡萄皮渣的產量也逐年增長[2],大部分酒廠將皮渣直接廢棄或閑置堆積,只有少量用作田間肥料、動物飼料或當燃料處理,不僅造成資源的大量浪費,同時對環境造成了嚴重污染[3]。

葡萄釀酒后的皮渣主要由葡萄皮(78%)和葡萄籽(16%)組成,含有大量多酚化合物、芳香化合物、葡萄籽油和膳食纖維等許多高營養價值的化合物[4-5]。研究表明,多酚類物質具有抗氧化和清除自由基的特性,對癌癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等疾病的預防具有積極作用[6-7],多酚提取物的抗氧化效果為VC的50倍,VE的20倍[8-10],具有較強的資源化開發潛力。多酚化合物的提取多采用有機溶劑提取法,該方法溶劑消耗量大,操作費時,且提取物中含有溶劑殘留,使多酚化合物的實際應用受到限制[11]。超聲波是一種彈性機械波,其萃取效果主要取決于它在溶劑中產生的空化效應和機械效應,能夠使溶劑最大程度地滲透到樣品基質中,增加固相和液相之間的接觸面積,從而使樣品中的有效成分迅速溶解到溶劑中[12-13];生物酶能夠水解植物纖維等組織,破壞植物細胞壁,進而充分釋放細胞內含物,有利于植物生物活性物質的提取,從而提高葡萄皮渣的利用價值[14]。超聲波輔助酶法可使生物活性成分提取過程更加簡單有效,并能有效提高提取的安全性,但目前采用超聲波輔助酶法提取葡萄酒皮渣中多酚的研究還未見報道。

本實驗以甘肅河西走廊產區釀酒葡萄主栽品種赤霞珠(Cabernet Sauvignon)釀酒后的皮渣為原料,對超聲波輔助酶法提取多酚的工藝條件進行優化,以期確定最佳提取工藝參數,為葡萄酒皮渣資源的合理開發利用提供理論依據和技術指導。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

赤霞珠葡萄酒皮渣 于2017年11月采自甘肅農業大學食品學院葡萄酒生產車間酒精發酵結束后皮渣;纖維素酶 酶活力400 U/mg,上海源葉生物科技有限公司;Folin-Ciocalteus顯色劑 北京索萊寶科技有限公司;氫氧化鈉 天津市百世化工有限公司;無水碳酸鈉 天津開發區海光化學制藥廠;沒食子酸 上海鼓臣生物科技有限公司。

SCIENTZ IID型超聲波細胞破碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;PHS-3C pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;TU-1810紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;TD5A-WS臺式低速離心機 東莞康潤實驗科技有限公司;CPJ214電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;恒溫水浴箱 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葡萄皮渣預處理 將酒精發酵結束后的赤霞珠葡萄酒皮渣經手工去籽后,置于鼓風干燥箱中60 ℃干燥24 h,粉碎機粉碎后得到葡萄皮粉末作為實驗原料備用。

1.2.2 單因素實驗設計

1.2.2.1 超聲時間對多酚得率的影響 準確稱取預先處理好的葡萄酒皮渣粉各0.500 g并溶于40 mL水中,加入纖維素酶25 mg,設置超聲功率300 W,超聲時間分別為5、10、15、20、25 min,在酶解溫度60 ℃、pH5.5的條件下酶解2.5 h。測定多酚得率，選出較佳超聲時間。

1.2.2.2 超聲功率對多酚得率的影響 超聲時間10 min,設置超聲功率分別為100、200、300、400、500 W,其他操作同1.2.2.1。測定多酚得率,選出較佳超聲功率。

1.2.2.3 酶解pH對多酚得率的影響 在超聲時間10 min,超聲功率300 W,酶解溫度60 ℃的條件下,調節酶解pH為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5,其他操作同1.2.2.1。測定多酚得率,選擇較佳酶解pH。

1.2.2.4 酶解溫度對多酚得率的影響 在超聲時間10 min、超聲功率300 W、酶解pH5.5的條件下,設置酶解溫度分別為50、55、60、65、70 ℃,其他操作同1.2.2.1。測定多酚得率,選出較佳酶解溫度。

1.2.3 正交試驗 根據單因素實驗結果,選取超聲時間、超聲功率、酶解pH、酶解溫度為實驗因素,采用L9(34)正交表,做四因素三水平正交實驗。通過測定各組樣品多酚得率,選出最佳工藝條件。試驗因素和水平設計見表1。

表1 正交試驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 葡萄皮渣多酚的測定 采用福林-肖卡法[15]測定葡萄皮渣多酚。吸取1 mL樣品溶液,加入5 mL蒸餾水、1 mL Folin-Ciocalteus顯色劑和3 mL 7.5% Na2CO3溶液。陰暗處室溫條件下放置2 h顯色后,在765 nm波長下測定吸光度,再根據總酚標準曲線方程(y=0.0775x+0.0032,R2=0.9985)計算樣品中多酚的得率。葡萄酒皮渣中多酚得率按以下公式計算:

式中,ω為多酚得率,%;C為根據標準曲線計算得到的多酚質量濃度,μg/mL;V為提取液的體積,mL;m為葡萄皮渣的質量,g。

1.3 數據處理

采用Excel 2010和SPSS 20.0處理數據并作圖,結果以平均值表示。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 超聲時間對多酚得率的影響 由圖1可知,不同超聲時間對葡萄皮渣中多酚得率影響顯著(p<0.05),隨著超聲時間的延長,葡萄皮渣中多酚得率增加,在超聲10 min時達到最大值(1.304%),之后超聲時間再增加,多酚得率顯著下降。這表明當超聲時間達到10 min時,葡萄皮渣中多酚化合物已充分浸出,提取量接近飽和,繼續延長超聲時間可使更多雜質溶出,加速多酚氧化,增加提取成本,并使葡萄皮渣中多酚得率減小[16]。因此,超聲時間宜選用10 min。

圖1 超聲時間對多酚得率的影響Fig.1 Effect of the ultrasonic time on the yield of polyphenols

2.1.2 超聲功率對多酚得率的影響 不同的超聲功率對葡萄皮渣多酚得率的影響較大。如圖2所示,隨著超聲功率的不斷增大,葡萄皮渣中多酚得率也隨之增加,當超聲功率為300 W時,多酚得率最高。當超聲功率超過300 W時,多酚得率呈顯著下降(p<0.05)。這主要是由于超聲功率的大小會直接影響超聲波的機械效應和空化效應。當超聲功率增大時,其機械效應和空化效應相應增強,從而增大介質分子的運動速度、強化介質的擴散、傳播,使多酚物質充分溶出,增加得率[17]。但當超聲功率過大,其強烈的空化效應易破壞目標產物,局部高溫易使多酚氧化分解,進而使多酚得率下降[11]。后續實驗選擇超聲功率300 W為宜。

圖2 超聲功率對多酚得率的影響Fig.2 Effect of the ultrasonic power on the yield of polyphenols

2.1.3 酶解pH對多酚得率的影響 如圖3所示,在pH4.0～5.0的條件下,多酚得率差異性較小,在pH為5.5時,多酚得率達到最大值;當pH超過5.5時,多酚得率顯著下降,且在pH6.0和pH6.5時,多酚得率無顯著性差異(p>0.05)。這可能與纖維素酶的最適酶解pH有關,當pH為5.5時,纖維素酶酶活力達到最大值,能夠充分水解植物纖維,破壞植物細胞壁,進而充分釋放細胞內的多酚物質;當pH超過纖維素酶的最適pH范圍時,其酶活性大大降低,且過高的pH可能會改變底物的解離狀態,從而影響酶與底物的充分結合,最終使多酚得率下降[14],因此選擇較佳的酶解pH為5.5。

圖3 酶解pH對多酚得率的影響Fig.3 Effect of the enzymolysis pH on the yield of polyphenols

2.1.4 酶解溫度對多酚得率的影響 由圖4可知,在酶解溫度為55 ℃時,多酚得率達到最大值,超過55 ℃后,多酚得率不再增加,其中70 ℃時多酚得率最小。適宜的高溫能夠促進多酚物質的充分溶解,但由于多酚物質在高溫下不穩定,易被氧化分解,因此,過高的溫度反而使多酚得率下降[18]。選擇55 ℃為較優酶解溫度。

圖4 酶解溫度對多酚得率的影響Fig.4 Effect of the enzymolysis temperature on the yield of polyphenols

2.2 正交試驗

根據單因素實驗結果,選取超聲時間、超聲功率、酶解pH、酶解溫度為實驗因素,進行L9(34)正交試驗,并應用SPSS 20.0對正交試驗結果進行方差分析。結果如表2、表3所示。

表2 正交試驗結果Table 2 Results of the orthogonal design

表3 方差分析表Table 3 Results of variance Analysis

通過正交試驗結果(表2)直觀分析可知,影響赤霞珠葡萄皮渣中多酚得率的主次因素依次為A>D>B>C,即超聲時間>酶解溫度>超聲功率>酶解pH。通過方差分析(表3)可知,因素A差異顯著(p<0.05),即超聲時間對葡萄皮渣多酚得率具有顯著性影響。試驗確定超聲波輔助酶法提取赤霞珠葡萄皮渣中多酚的最佳工藝條件為A3B3C3D3,即超聲時間15 min,超聲功率400 W,酶解pH6.0,酶解溫度60 ℃。

2.3 工藝條件驗證

對正交試驗得到的最佳工藝條件進行驗證實驗,在最佳工藝條件下,進行三次重復實驗,得到赤霞珠葡萄皮渣中多酚的平均得率為1.493%±0.0068%,其結果高于正交試驗中任一組合的多酚得率,表明正交試驗確定組合為提取赤霞珠葡萄皮渣中多酚的最佳工藝參數。

3 結論

本實驗通過單因素實驗,并采用L9(34)正交試驗設計對赤霞珠葡萄皮渣多酚的提取條件進行了優化,確定最佳提取工藝參數為:超聲時間15 min,超聲功率400 W,酶解pH6.0,酶解溫度60 ℃,在此條件下多酚得率達1.493%±0.0068%。超聲波輔助酶法提取葡萄皮渣多酚具有工藝穩定可行,環保節能且能夠保持葡萄皮渣中的有效活性成分等優點,是提取葡萄皮渣多酚的有效途徑。