藏靈菇發酵螺旋藻酸乳工藝條件優化及其揮發性風味物質

顏志秀,陸思宇,孟麗娜,潘 晴,趙晨煊,李博生

(北京林業大學生物科學與技術學院,北京 100083)

藏靈菇(Tibetan kefir),又稱雪蓮菌[1]、“西藏雪蓮”[2]、“天山靈菇”,是源于西藏地區的一種呈淺黃色或乳白色、膠質狀、不規則塊狀物的特有菌種,其表面是一個復雜的菌相體系,附著有酵母菌、醋酸菌、乳酸菌等多種微生物[3-5]。藏靈菇用于家庭作坊發酵牛乳并流傳至今[6],可延長牛乳貨架期[7],長期飲用具有增強機體免疫力[8-9]、抗癌抗腫瘤[10]、改善腸道環境[11-12]、降低血液膽固醇[13]、治療燒傷[14]等保健功能。螺旋藻(Spirulina)是一種低級光能自養型原核生物[15],含有豐富的蛋白質和多糖,還含有β-胡蘿卜素、亞麻酸、亞油酸、維生素和膽堿等生物活性物質[16],具有潛在的臨床應用價值[17-18]。目前,越來越多的研究者開始關注螺旋藻的開發,市面上已經出現了將螺旋藻與酸乳集合為一體的營養保健酸乳[19]、螺旋藻草莓酸奶[20]以及螺旋藻巧克力果凍[21]等。迄今為止,針對單方面的藏靈菇發酵乳[22]以及螺旋藻酸奶的研究較多,但將二者結合的研究很少。

本文以螺旋藻和牛奶的混合物作為發酵基質,利用藏靈菇進行發酵,應用響應面法(Response surface methodology,RSM)對影響酸乳感官評分較大的四個因素,即螺旋藻提取液添加量、藏靈菇接種量、發酵時間、蔗糖添加量進行優化,以期研制出色澤、口感、形態、氣味均較好的酸乳產品。并以普通原味酸奶作對照,采用HS-SPME和GC-MS聯用技術,對兩種酸乳中的揮發性風味成分進行測定和比較,研究藏靈菇發酵螺旋藻酸乳在風味上的特點和優勢,為其市場應用及推廣奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藏靈菇 同一批次購買,于同一環境中進行菌種活化,來自西藏農業研究所;螺旋藻干粉 內蒙古鄂爾多斯再回首有限公司;純牛奶和風味酸乳 伊利乳品有限責任公司;蔗糖、β-環糊精 食品級,天津市光復科技發展有限公司;其他試劑 均為國產分析純。

YXQ-LS-50立式壓力蒸汽滅菌器 Thermo Fisher Scientific;SCGZ-1102C光照恒溫搖床 金壇市科析儀器有限公司;KQ3200DE超聲波發生器 昆山市超聲儀器有限公司;721型紫外/可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;Agilent5975-6890氣質聯用儀 美國安捷倫公司;D-37520冷凍離心機 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;HH-4恒溫水浴鍋 上海勇誠實業發展有限公司;DL-1電子萬用爐 北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 藏靈菇發酵螺旋藻酸奶的工藝流程 取一定量的螺旋藻干粉制成5%的螺旋藻水溶液,冰浴條件下超聲破壁處理15 min,添加3%的β-環糊精及3%的蔗糖對其進行加熱包埋,2000 r/min冷凍離心30 min后,取上清液得螺旋藻提取液。螺旋藻提取液與一定量的牛乳和蔗糖混合調配,60 ℃巴氏殺菌30 min,迅速冷卻至室溫,接入一定量活化的藏靈菇菌種,在一定溫度下發酵一段時間,轉入-4 ℃冰箱過夜后熟得到發酵產品。

1.2.2 單因素實驗 根據文獻[23]可知,酸乳的酸度由乳糖發酵產生乳酸引起,酸度高低與pH大小相反,pH越小,酸度越高,反之,pH越大,酸度越低,酸奶酸度的高低不僅影響酸奶的凝膠特性,還嚴重影響酸奶的風味。本實驗采取1.2.1的方法進行藏靈菇發酵螺旋藻酸奶的制作,設定產品體積為50 mL,考察發酵溫度、發酵時間、藏靈菇接種量、螺旋藻提取液添加量和蔗糖添加量對產品pH、酸度和感官品質的影響。

1.2.2.1 發酵溫度對產品品質的影響 固定蔗糖添加量6%、藏靈菇接種量3%、螺旋藻提取液添加量9%、發酵時間14 h,考察不同發酵溫度(4、23、28、37、42 ℃)對產品pH、酸度和感官品質的影響。

1.2.2.2 發酵時間對產品品質的影響 固定蔗糖添加量6%、藏靈菇接種量3%、螺旋藻提取液添加量9%、發酵溫度28 ℃,考察不同發酵時間(10、12、14、16、18 h)對產品pH、酸度和感官品質的影響。

1.2.2.3 藏靈菇接種量對產品品質的影響 固定蔗糖添加量6%、螺旋藻提取液添加量9%、發酵時間14 h、發酵溫度28 ℃,考察不同藏靈菇接種量(1%、2%、3%、4%、5%)對產品pH、酸度和感官品質的影響。

1.2.2.4 螺旋藻提取液添加量對產品品質的影響 固定蔗糖添加量6%、藏靈菇接種量3%、發酵時間14 h、發酵溫度28 ℃,考察不同螺旋藻提取液添加量(5%、7%、9%、11%、13%)對產品pH、酸度和感官品質的影響。

1.2.2.5 蔗糖添加量對產品品質的影響 固定藏靈菇接種量3%、螺旋藻提取液添加量9%、發酵時間14 h、發酵溫度28 ℃,考察不同蔗糖添加量(2%、4%、6%、8%、10%)對產品pH、酸度和感官品質的影響。

1.2.3 響應面試驗 在單因素實驗基礎上,選取四個主要因素,每個因素選取三個對感官品質得分影響較大的水平,建立四因素三水平的Box-Benhnken中心組合實驗,以感官品質得分為響應值,各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼,如表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface test

1.2.4 指標的測定 采用pH計測定產品pH;參考GB 5413.34-2010[24]進行產品酸度測定。參考文獻[25]進行感官品質測定,選取色澤、氣味、組織狀態、口感為四個主要影響因素,具體評分標準見表2;感官評價小組由10位食品專業具備感官評價經驗的學生組成,進行相關評價標準的學習,完成評分后取平均分作為樣品最終得分。

表2 感官評分標準Table 2 Standard of sensory evaluation

1.2.5 揮發性風味物質的測定

1.2.5.1 樣品前處理 根據文獻[26]和前期實驗條件探索,取2.5 g酸乳樣品與1 g NaCl及2.5 mL超純水置于15 mL萃取瓶中,密封搖勻,加熱至45 ℃鹽析40 min,插入老化的SPME萃取頭,推出1 cm纖維頭,頂空恒溫吸附30 min,迅速插進GC-MS進樣口解吸5 min,用于GC-MS上機檢測。

1.2.5.2 GC/MS條件 GC條件:色譜柱:DB-624石英毛細管柱(60 m×0.25 mm×1.40 μm);程序升溫:初溫40 ℃保持1 min,以8 ℃/min升溫至220 ℃,保持2 min,再以4 ℃/min升溫至250 ℃,保持20 min;載氣:高純He(99.999%),流速1.0 mL/min;進樣模式:不分流進樣;節省氣:20.0 mL/min;進樣口溫度:250 ℃;GC-MS接口溫度:280 ℃。MS條件:電子電離源;電離能量:70 eV;離子源溫度:230 ℃,四極桿溫度:150 ℃;質量掃描范圍m/z:30～500。

1.2.5.3 定性和定量方法 定性:根據計算機檢索與NIST 11s標準質譜圖匹配定性,選取匹配度大于80(最大值100)的結果,并參考文獻對檢索結果進行核對和確認。定量:按照各組分峰面積歸一化法計算各組分的相對含量。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果

圖1 不同發酵溫度對酸度和pH的影響Fig.1 Effects of different fermentation temperatures on the acidity and pH

圖2 不同發酵溫度對感官品質的影響Fig.2 Effects of different fermentation temperatures on the sensory quality

2.1.2 發酵時間對pH、酸度和感官品質的影響 圖3、圖4分別為不同發酵時間對酸度、pH以及感官評分的影響。發酵時間是影響酸乳發酵的重要因素,發酵時間不足,發酵效果差,酸乳風味不明顯;發酵時間過長,酸乳過度發酵,乳清分離嚴重,凝塊較多,組織不均勻,口感粗糙,產品感官品質變差。由圖3可知,發酵時間為10～18 h之間時,酸度平穩升高,pH平穩下降,當發酵時間在pH和酸度曲線交點附近對應的14 h時,pH和酸度分別為4.5和75 °T,此時發酵效果較好,酸度適中。結合圖4感官評分可知,在14 h達到感官評分最大值。可見,發酵時間14 h更適合藏靈菇發酵螺旋藻酸乳的研制。

圖3 不同發酵時間對酸度和pH的影響Fig.3 Effects of different fermentation time on the acidity and pH

圖4 不同發酵時間對感官品質的影響Fig.4 Effects of different fermentation time on the sensory quality

2.1.3 藏靈菇接種量對pH、酸度和感官品質的影響 圖5、圖6分別為不同接種量對酸度、pH以及感官評分的影響。藏靈菇的接種量較低時,發酵效果不明顯;接種量較大時,發酵周期變短,過度發酵,酸度過大,乳清分離,凝塊較多,感官品質嚴重下降。由圖5可知,藏靈菇接種量在1%～5%之間時,酸度呈升高的趨勢,pH呈下降趨勢,當接種量在pH和酸度的交點附近對應的3%時,酸度和pH分別為75 °T和4.5左右,此時發酵效果較好,酸度適宜。結合圖6可知,接種量在3%時感官評分最高。因此選擇藏靈菇接種量為3%。

圖5 不同接種量對酸度和pH的影響Fig.5 Effects of different amounts of inoculation on the acidity and pH

圖6 不同接種量對感官品質的影響Fig.6 Effects of different amounts of inoculation on the sensory quality

2.1.4 螺旋藻提取液添加量對pH、酸度和感官品質的影響 圖7、圖8分別為不同螺旋藻提取液添加量對酸度、pH以及感官評分的影響。由圖7可知,隨著螺旋藻提取液添加量的增加,牛乳添加量相應減少,酸度呈增加趨勢,pH不斷下降,但兩者整體浮動較小,說明螺旋藻提取液添加量在此區間內對酸度和pH影響較小。由圖8可知,感官評分隨螺旋藻提取液添加量的增加先升后降,螺旋藻添加量為9%時,感官評分最高。結合酸乳酸度變化不大,因此,選擇的螺旋藻提取液添加量為9%。

圖7 不同螺旋藻提取液添加量對酸度和pH的影響Fig.7 Effects of different amounts of spirulina extract on the acidity and pH

圖8 不同螺旋藻提取液添加量對感官品質的影響Fig.8 Effects of different amounts of spirulina extract on the sensory quality

2.1.5 蔗糖添加量對pH、酸度和感官品質的影響 圖9、圖10分別為不同蔗糖添加量對酸度、pH以及感官評分的影響。由圖9可知,由于藏靈菇發酵產生有機酸,隨著蔗糖添加量的增加,酸度不斷上升,但變化范圍處于70～85 °T 之間,在整個蔗糖添加量變化區間內酸度變化不大,pH亦然。由圖10可知,感官評分隨蔗糖添加量的增加先增后減,蔗糖添加量為6%時,感官評分達最大值。由于蔗糖添加量偏低時,酸乳甜味低,而蔗糖添加量偏高時,酸乳較甜,所以偏高偏低均影響產品感官品質。結合圖9在蔗糖添加量為6%時,酸乳酸度和pH適宜,因此,選擇的蔗糖添加量為6%。

圖9 不同蔗糖添加量對酸度和pH的影響Fig.9 Effects of different amounts of sucrose on the acidity and pH

圖10 不同蔗糖添加量對感官品質影響Fig.10 Effects of different amounts of sucrose on the sensory quality

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計及結果 根據單因素實驗結果,由Design-Expert 8.0.6統計分析軟件設計出的實驗方案和實驗結果如表3所示。

表3 響應面試驗設計及結果Table 3 Design and results of response surface methodology

2.2.2 回歸方程擬合和方差分析 采用Design-Expert 8.0.6統計軟件對所得數據進行回歸分析擬合,得到回歸方程模型方差分析表(表4),并獲得四元二次多項回歸方程:

Y=86.86-0.14A-2.10B-1.83C+1.94D-0.50AB+1.08AC-2.10AD+0.23BC+2.18BD+1.25CD-3.89A2-6.35B2-6.55C2-0.74D2

回歸模型的R2=0.9519,由表4方差分析可知,模型p<0.0001,模型極顯著,說明該模型與實際擬合良好,實驗方法可靠;失擬項(p=0.3137)>0.05,說明方程與實際擬合中非正常誤差所占比例小,可用該回歸方程代替實驗真實點對實驗結果進行分析。此外,藏靈菇接種量(B)、蔗糖添加量(C)、發酵時間(D)、螺旋藻提取液添加量二次項(A2),藏靈菇接種量二次項(B2)、蔗糖添加量(C2)對響應值影響極顯著(p<0.01);螺旋藻提取液添加量與蔗糖添加量交互項(AD),藏靈菇接種量與蔗糖添加量交互項(BD)對響應值影響顯著(p<0.05)。各因素對響應值顯著性的排序為B>D>C>A。

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表4 回歸方程模型的方差分析Table 4 Variance analysis of mathematical regression model

2.2.3 響應面和等高線圖分析 如圖11所示,圖11(a)和圖11(b)曲面陡峭,說明螺旋藻提取液添加量和蔗糖添加量、藏靈菇接種量和蔗糖添加量之間交互作用較明顯,與方差分析結果相符。

圖11(a)表明,當藏靈菇接種量和發酵時間為零水平,螺旋藻提取液添加量較低時,感官評分隨蔗糖添加量增加先快速上升后趨于平緩,螺旋藻提取液添加量較高時,感官評分隨蔗糖添加量增加小幅度上升,趨于平緩;固定蔗糖添加量不變,感官評分隨螺旋藻提取液添加量增加呈先上升后下降的趨勢,綜合來看,蔗糖添加量上升的幅度較螺旋藻提取液添加量陡峭,蔗糖添加量對感官評分的影響較大。圖11(b)表明,當螺旋藻提取液添加量和發酵時間為零水平,感官評分隨藏靈菇接種量的增加,先快速升高后快速下降,隨蔗糖添加量的增加急劇上升后趨于平緩,且蔗糖添加量的上升幅度明顯大于藏靈菇接種量的上升幅度,說明蔗糖添加量影響較大。

圖11 各因素的交互作用對感官評分影響的響應面及等高線圖Fig.11 Response surface and contour plot of the effect of various factors on sensory evaluation score

2.2.4 驗證實驗 對回歸方程進行求解,即感官品質得分最大時的發酵條件為螺旋藻提取液添加量8.70%,藏靈菇接種量3.01%,發酵時間13.93 h,蔗糖添加量7.00%,感官評分最高可達88.42,為方便實際操作將實驗條件定為螺旋藻提取液添加量9%,藏靈菇接種量3%,發酵時間14 h,蔗糖添加量7%。在此條件下進行三次平行實驗,驗證實驗所得感官評分為88.1±0.32,與響應回歸方程擬合出的理論值相吻合,說明響應面法可以有效優化藏靈菇發酵螺旋藻酸乳的工藝條件。

2.3 揮發性風味物質的測定結果

采用HS-SPME和GC-MS聯用技術,以普通原味酸乳作為對照,得到藏靈菇發酵螺旋藻酸乳和普通酸奶的總離子流圖分別如圖12和圖13所示,對其進行定性和定量分析,結果如表5所示。從表5可以看出,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳及普通酸乳揮發性風味物質在總體組成上差別較大。藏靈菇發酵螺旋藻酸乳的揮發性風味物質共檢測到41種,由醛類6種(43.68%)、酯類8種(26.83%)、醇類8種(11.18%)、酮類9種(10.49%)、酸類7種(5.68%)、其他3種(2.14%)組成;普通酸乳的風味物質共檢測到25種,由酸類9種(28.76%)、醛類3種(25.95%)、酯類5種(23.02%)、酮類5種(10.22%)、醇類2種(4.17%),其他1種(7.88%)組成。其中,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳與普通酸乳相同的揮發性風味物質有12種,占藏靈菇發酵螺旋藻酸乳總風味成分的68.85%,不同的揮發性風味物質29種,占總成分的31.15%。

表5 藏靈菇發酵螺旋藻酸乳和普通酸乳揮發性成分及相對含量Table 5 Volatile compounds and their relative content identified in the product and general yoghurt

續表

圖12 藏靈菇發酵螺旋藻酸乳中揮發性風味物質的總離子流圖Fig.12 Total ion chromatogram of volatile compounds in the Tibetan mushroom fermented spirulina yoghourt

圖13 普通酸乳中揮發性風味物質的總離子流圖Fig.13 Total ion chromatogram of volatile compounds in the general yoghurt

醛類化合物作為發酵乳制品中重要的風味物質之一,是各種氧化風味的來源,其風味閾值一般較低,對風味作用較大[27-28]。藏靈菇發酵螺旋藻酸乳中醛類風味物質占比較大,達到43.68%,而普通酸乳只含有25.95%。從表6可以看出,兩種酸乳都含有對甲基苯甲醛(分別為33.05%、20.72%)和2,4-二甲基苯甲醛(分別為3.99%、5.16%),且含量都較高,根據化合物CAS號查詢可知,苯甲醛類物質具有特殊的櫻桃、苦杏仁、及堅果香氣,是酸乳的主要風味物質。此外產品酸乳中檢測到了特有的甘油醛、丁醛、辛醛、十八醛,給產品酸乳增添了淡淡的桃花香、風信子花香味和水果甜香味。

酯類化合物主要通過脂肪酸水解和分子較小的酸、醇類合成及微生物代謝產生,其風味閾值非常低,對風味作用很大[27,29]。從表6可以看出,兩種酸乳酯類化合物相對含量相似(分別為26.83%、23.02%),且含有共同的風味成分乳酸乙酯(分別為21.42%、18.19%)和乙酸仲丁酯(分別為0.95%、1.94%),乳酸乙酯具有特殊的朗姆酒、水果和奶油氣味,微甜,有濃厚感,略帶澀味,能增加酸乳的醇甜感;乙酸仲丁酯有果子樣香氣。藏靈菇發酵螺旋藻酸乳中含有特有的癸酸乙酯、十二碳三烯酸甲酯、酞酸二甲酯、丁位癸內酯、2-辛烯-3-醇乙酸酯、鄰苯二甲酸二異丁酯,增添了梨、椰、桃的果香味、白蘭地的酒香味、奶油香味和蘑菇香味,摒除了不愉快氣味。

酸類化合物也是酸乳的主要風味物質[27,29],其風味不僅表現在滋味上,還表現在氣味上。兩種酸乳酸類化合物含量差異較大,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳只含有5.68%,而普通酸乳中達到28.76%。由表6可知,兩種酸乳均含有己酸(分別為0.79%、0.33%)、辛酸(分別為1.32%、2.73%)、癸酸(分別為0.12%、0.22%)和棕櫚酸(分別為1.00%、5.48%),其中己酸主要用以配制椰子和漿果類香精,具有椰子油氣味和汗臭味;辛酸在適當的稀釋后呈現水果香氣;癸酸具有難聞的腐臭味,是月桂酸生成時的副產物;棕櫚酸具有椰子油、棕櫚仁油氣味。藏靈菇發酵螺旋藻酸乳檢測到特有的乙酸(0.72%)、戊酸(0.91%)、壬酸(0.82%),但不含有普通酸乳中的丁酸(10.13%)、苯甲酸(1.21%)、油酸(2.46%)、二十酸(6.00%)。一般認為,酸奶中酸類化合物含量略高會產生較多刺激性氣味,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳很好地避開了這一點,減弱了酸乳尖酸的口感,風味更加柔和。

酮類化合物對風味的貢獻較大,不飽和脂肪酸氧化和氨基酸降解及微生物代謝是獲得酮類化合物主要途徑[27-29]。從表6可知,兩種酸乳中酮類化合物含量相近,分別為10.49%、10.22%,都含有2-庚酮(分別為3.63%、1.00%),呈強烈果香和醚香;丙酮(分別為0.67%、0.87%),有類似薄荷的微弱香氣,是我國允許使用的食用香料;5-羥基-2-戊酮(分別為0.77%、1.49%),具有芳香氣味。藏靈菇發酵螺旋藻酸乳中特有的酮類化合物包括2,4-二甲基二苯甲酮、2-戊酮、2-十一酮、苯并呋喃酮、3-羥基-2-丁酮,使其增添了酒香味、奶油香味、肉香味以及柑橘、桃、草莓的果香味。

醇類化合物的風味閾值高,對風味的影響不大[28-29],主要由乳酸菌發酵糖類物質產生,可與乳香味平衡來豐富發酵乳的風味[30]。由表5可以看出,兩種酸乳不含有相同的醇類化合物,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳檢測到的特有的醇類化合物較多,有異戊醇、乙醇、辛醇、正己醇、2-庚醇、1-甲基環庚醇、甲基戊醇、1-庚炔-3-醇,普通酸乳中檢測到的醇類化合物只有兩種,即1-乙氧基-2-丙醇(3.11%)和4-甲基-3-庚醇(1.06%)。綜上可知,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳中的醇類化合物種類遠遠多于普通酸乳,增添了典型的酒香味,豐富了酸奶的風味。兩種酸乳均檢測到一定量的烴類化合物,但含量較低,對風味貢獻不大。

3 結論

采用響應面法對藏靈菇發酵螺旋藻酸乳的工藝條件進行優化,建立了感官評分的回歸模型,由該模型優化的藏靈菇發酵螺旋藻酸乳的工藝條件為螺旋藻提取液添加量9%、藏靈菇接種量3%、發酵時間14 h,蔗糖添加量7%、發酵時間28 ℃。此條件下的感官評分為88.1±0.32,與模型擬合理論值結果相近,進一步驗證了該模型的可靠性。采用HS-SPME和GC-MS聯用技術對藏靈菇發酵螺旋藻酸乳的揮發性風味成分進行測定,以普通原味酸乳作為對照,結果表明,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳共檢測到41種揮發性風味物質,主要由6種醛類(43.68%)、8種酯類(26.83%)、8種醇類(11.18%)、9種酮類(10.49%)、酸類7種(5.68%)組成;而普通酸乳共檢測到25種風味物質,主要由3種醛類(25.95%)、5種酯類(23.02%),2種醇類(4.17%)、5種酮類(10.22%)和9種酸類(28.76%)組成。由此可見,除酸類化合物外,藏靈菇發酵螺旋藻酸乳中醛類、酯類、酮類和醇類化合物的種類和含量均比普通原味酸乳高,使其在酸味降低的同時,風味上更加豐富和獨特,為開發新型酸乳制品提供參考。