產酒精熱帶假絲酵母突變株的五、六碳糖共代謝分析

楊 薇,王巧云,鄧永東,吳學鳳,王華林,鄭 志,李興江,*

(1.天津農學院,天津 300384; 2.合肥工業大學食品與生物工程學院,安徽合肥 230009)

長期以來,谷物糧食一直都是乙醇生產的主要原料,而隨著人口的增長和可利用資源的減少,尋找清潔可再生的新能源-生物質乙醇受到了廣泛關注[1]。同時,農作物秸稈、木材、林業加工廢料和廢棄紙品等是主要的廢棄生物質原料,每年大量的生物質原料由于得不到充分利用而被舍棄。富含纖維素和半纖維素的生物質是最有潛力的乙醇生產原料,其組成一般為:纖維素32%～41%,半纖維素36%～47%,木質素14%～26%[2],并且纖維素原料是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。因此,利用纖維素水解制糖,進而生物轉化生產乙醇具有重要意義。

纖維素的主要水解產物是六碳糖(以葡萄糖為主)及五碳糖(以木糖為主)等,對葡萄糖和木糖的有效利用是生物轉化生產乙醇的關鍵節點之一。葡萄糖是一種容易利用的碳源,大多數微生物都可以利用葡萄糖發酵生產乙醇,而大多數微生物對木糖的利用率很低。研究報道,在利用木糖發酵的微生物中,發酵能力最強的是酵母,能夠利用戊糖發酵的三種酵母分別為管囊酵母(Pachysolentannophilus)、邏輯樹干畢赤酵母(Pichiastipitis)和熱帶假絲酵母(Candidatropicalis),充分利用纖維質原料中的木糖,可使酒精的產量在原有基礎上增加25%甚至更高[3-4]。目前,研究主要涉及的是管囊酵母和邏輯樹干畢赤酵母五、六碳糖共發酵菌種的選育,管囊酵母、邏輯樹干畢赤酵母對酒精和抑制劑耐受度低,限制了其在工業上的應用[5],并且關于共發酵代謝分析方面目前也鮮有研究。

因此,本研究采用紫外誘變法對熱假絲酵母進行選育,通過色譜法研究代謝通量,對其共發酵產酒精代謝分析開展研究,以期為工業上纖維素廢棄原料的有效利用提供有效參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱帶假絲酵母CICC1779 合肥工業大學農產品加工院保藏;其他試劑 國藥集團化學試劑有限公司;斜面培養基(1 L):葡萄糖20 g、酵母粉10 g、蛋白胨20 g、瓊脂20 g;液體培養基(1 L):葡萄糖20 g、酵母粉10 g、蛋白胨20 g;TTC 下層培養基(1 L):木糖10 g、蛋白胨2 g、酵母粉1.5 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.4 g、瓊脂30 g,pH5.5～5.7;TTC 上層培養基(1 L):木糖0.5 g、瓊脂1.5 g、TTC 0.05 g;發酵培養基(1 L):葡萄糖30 g、木糖30 g、硫酸銨5 g、磷酸二氫鉀1 g、酵母膏1 g、七水硫酸鎂1 g。

756MC紫外分光光度計 上海第三分析儀器廠;FE20實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;MC酒精計 上海長城儀器廠;WYT-4型手持糖量計 泉州中友光學儀器有限公司;RE-85Z旋轉蒸發儀 上海五相儀器儀表有限公司;Waters 2695 高效液相色譜儀 沃特斯科技(上海)有限公司;Agilent 7890A型氣相色譜儀 安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種篩選

1.2.1.1 紫外誘變 將熱帶假絲酵母CICC1779轉移至斜面培養基上,于30 ℃下培養至對數生長期,用生理鹽水調節菌液濃度為109CFU/mL。在磁力攪拌器作用下于紫外燈下(20 W、25 cm)分別照射20～80 s[6]。稀釋誘變后的菌液并涂布于木糖唯一碳源固體平板上,30 ℃避光培養2 d[7]。然后挑選長勢良好的菌株,接種到以濃度為200 g/L的木糖為唯一碳源篩選培養基上培養1～2 d。

1.2.1.2 初篩 配制木糖液體發酵培養基,滅菌(121 ℃,20 min),用移液槍將培養液加到杜氏小管至10 mL,迅速將杜氏小管倒入試管中,在固體培養基中沾取少許菌落,放入試管中攪拌,用封口膜封口,并放入恒溫培養箱中培養2 d,觀察杜氏小管中的氣泡情況[8],選取產氣較多的突變株進行復篩。

1.2.1.3 復篩 在木糖固體培養基上培養初篩單菌落,待菌落長出后在其上面倒入TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)選擇培養基,陰暗處30 ℃恒溫培養2 h,觀察選擇培養基內各個菌落的顏色,挑選出顏色較紅的菌落用于后續研究[9]。

1.2.2 生長曲線的測定及種子液的制備 將篩選得到的菌株接種到液體培養基,每隔2 h在波長600 nm下測定其OD值,確定其生長曲線。然后再培養至對數生長期,制備成種子液備用。

1.2.3 發酵工藝 將培養至對數生長期的種子液接種至121 ℃滅菌15 min的液體培養基中發酵,發酵溫度設定為34 ℃,初始pH調節到4。發酵96 h[10]。

1.2.4 指標測定方法 糖含量測定采用液相色譜法[11];色譜條件:Waters Carbohydrate Analysis Column(3.9 mm×300 mm)色譜柱;流動相為80%乙腈-20%水,0.22 μm微孔濾膜過濾。超聲脫氣30 min,進樣量為20 μL,流速為1.0 mL/min,柱溫為30 ℃。根據外標法定量計算樣品中糖含量,葡萄糖標準曲線方程為y=8.67143x-0.00524,R2=0.996,在0～0.1 mg/mL的范圍內線性良好;木糖標準曲線方程為y=4.53995x+0.02194,R2=0.993,在0～0.2 mg/mL的范圍內線性良好。

乙醇含量的測定采用氣相色譜法[12],檢測條件:色譜柱為ZB-624,柱溫100 ℃(1 min),15 ℃/min,190 ℃(3 min);柱流量為高純氮30 mL/min(恒流);氣體流量為氫氣400 mL/min,空氣400 mL/min;進樣口200 ℃;檢測器250 ℃。根據外標法定量計算樣品中乙醇含量,乙醇標準曲線方程為y=13.01x-0.223,R2=0.998,在乙醇和正丙醇之比在1∶2的范圍內線性良好。

菌體重量采用恒溫干燥法測量:將濾紙于105 ℃下烘干至恒重,取100 mL 樣品液于6000 r/min離心10 min,去上清液,將沉淀用蒸餾水洗滌2～3次后置于80 ℃烘干至恒重稱量,計算菌體干重。

1.2.5 代謝網絡構建及流量分析 代謝通量分析是進行計算細胞內代謝產物流量分布的有效分析手段,是在擬穩態的基礎上來進行計算的,即假定段時間內中間體的量不變,計算公式為:

r=GTV

其中,向量r為代謝物凈形成速率(mmol/(g DW·h)),V為內部反應速率(mmol/(g DW·h))。G為總化學計量矩陣用于所有反應物和反應產物。代謝通過EXCEL 2007的MMULT和MINVERSE進行計算[13]。

1.3 數據處理

根據Design expert 8.0.6.1和Origin 9.0進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 突變菌株篩選結果

2.1.1 突變菌株初篩結果 酵母菌產氣的時間越早,產氣量越多,代表酵母菌的發酵性能越好。在進行酵母菌研究時,應選取產氣量較多的酵母菌。表1顯示的是突變菌的杜氏小管產氣表。由表1可知,在誘變的菌株中,產氣泡最多的六種菌株的編號分別是T70-2、T110-1、T30-1、T50-1、T70-3和T90-2。選擇這六株產量較高的菌株進行下一步的篩選。

表1 杜氏小管產氣結果Table 1 The results of Dushi tube gas production

2.1.2 突變菌株復篩結果 突變菌株的復篩單菌落如圖1所示。TTC(2,3,5.氯化三苯基四氮唑)是一種與酵母的代謝產物發生顯色反應的顯色劑,通過它可以判斷酵母呼吸酶活力的大小,間接反映酵母產酒精能力的高低。在培養基上的酵母菌落上覆蓋一層TTC顯色劑,菌落會顯示不同的顏色,產酒精能力強的酵母會顯現深紅色,次之為粉紅色、微紅色或不顯色[15-16]。從圖1中篩選出最紅的單菌落(T70-2)作為后面研究的菌株,并將此菌株命名為:熱帶假絲酵母 CICC1779-T70-2。

圖1 TTC顯色單菌落圖Fig.1 Single colony map of TTC coloration

2.2 原始菌和突變菌生長曲線對比分析

原始菌和突變菌的生長曲線如圖2,由圖2(A)可知,原始菌株在以葡萄糖為唯一碳源的條件下能較好生長,且呈現良好的S型生長曲線,在13 h附近達到對數生長期,此時菌體生長最為旺盛,在20 h 左右達到最大OD值1.6,隨后進入穩定期。但在以木糖為唯一碳源條件下生長緩慢,無明顯的對數期,其最大OD值只能達到以葡萄糖為碳源條件下的1/3(0.6),說明相比葡萄糖,原始菌對木糖的適應性較差,在以木糖為唯一碳源條件下不能較好生長。

經過突變篩選得到的菌株其生長曲線如2(B)所示。由圖2(B)可知,突變菌株在以葡萄糖為唯一碳源的條件下依舊能較好生長,呈現良好的S型生長曲線。在10 h附近達到對數生長期,相比較原始菌提前了3 h,其最大OD值和原始菌相似,保持在1.6左右。突變菌在以木糖為唯一碳源條件下也能較好生長,在12 h附近進入對數生長期,滯后于以葡萄糖為碳源條件下的時間。其最大OD值約為1.1,相比較原始菌以木糖為碳源條件下有明顯提升。

圖2 原始菌(A)和突變菌(B)生長曲線Fig.2 Growth curve of the original and mutant strain

2.3 原始菌和突變菌發酵結果對比分析

圖3表示原始菌株和突變菌株發酵過程中葡萄糖濃度(a)、木糖濃度(b)、菌體濃度(c)和乙醇濃度(d)的變化情況。由圖3(a)可知,葡萄糖濃度整體下降的比較明顯,原始菌株和突變菌株對葡萄糖的利用情況都較好,在72 h時利用率利用率分別接近95%、96%。由圖3(b)可知,原始菌株和突變菌株對木糖的利用率有明顯差別。原始菌株發酵時,木糖的濃度在前24 h下降緩慢,24～72 h下降速度較快,在72 h之后木糖含量趨于穩定,其殘糖量接近13.25 g/L,木糖的利用率只能達到55.8%;突變菌株發酵時,木糖濃度整體下降速度較快,木糖在36 h之后也呈現較快下降趨勢,72 h木糖濃度僅為5.16 g/L,在84 h左右趨于穩定,其殘糖量接近2.32 g/L,木糖的利用率達到92.2%。隨著對葡萄糖和木糖的代謝分解,菌體開始大量繁殖,原始菌和突變菌的菌體濃度都開始上升,如圖3(c)所示;菌體代謝葡萄糖、木糖,乙醇濃度開始上升,突變菌發酵產生的乙醇濃度在72 h時達到最大濃度22.85 g/L,但由于原始菌對木糖的利用率較低,乙醇產量最終也只有17.58 g/L,說明此突變菌對比原始菌,對木糖的利用轉化率有較大提高。

圖3 原始菌和突變菌發酵過程中成分濃度變化Fig.3 Variations in the concentration of components of the original and mutant strain during fermentation process

2.4 突變菌共代謝流量分析

圖4為酵母菌五、六碳糖的代謝網絡和代謝方程,表2給出了各個關鍵酶中間體的催化過程,表3列出32個節點的流量方程式。其中方程式1～19依據的是代謝體物質的量平衡公式,方程式20～28的系數常量依據參考文獻[17-18]。底物輸入、產物輸出、細胞生成量都是直接檢測的。細胞生物量在60～72 h接近平衡,特別選擇此時期進行代謝通量分析。整體通量數據有32個未知量對應32個反應式,通過EXCEL 2007矩陣計算得到通量結果,結果如表4所示。

圖4 突變菌株代謝網絡Fig.4 Metabolic network of mutant strains

表2 突變菌株代謝反應Table 2 Metabolic reactions of mutant strains

續表

表3 突變菌株代謝方程Table 3 Metabolic equation of mutant strain

表4 突變菌株代謝流量數值表(mmol/(g DW·h))Table 4 Metabolic flux values of mutant strains(mmol/(g DW·h))

原始菌株和突變菌株的代謝流量見表4,輸入底物與產物通量變化與葡萄糖、木糖的消耗變化以及乙醇產量變化相吻合。由表4可知,突變菌株整體的代謝流量明顯高于原始菌株,尤其在幾個關鍵節點木糖的消耗流量明顯加快,從J5到J6再到J7、J8的流量增大,說明了突變菌株對木糖的代謝增強,同時丙酮酸流向乙醛的流量也顯著增加,J21和J22流量的增大,充分說明了突變菌株有更多的流量流向了乙醇,乙醇產量顯著提升。原始菌不能有效代謝木糖,是由于其缺乏木桐糖酶,無法將木糖轉化為木糖醇,戊糖磷酸途徑無法順利進行[19]。突變菌對木糖的代謝能力明顯增強,主要是由于突變菌株可以提供木桐糖酶,保證了戊糖磷酸途徑J5、J6、J7的順利進行,使突變菌株更能適應木糖環境下的生長和代謝,提高了突變菌株對木糖的利用率,增加了乙醇的產率。本文通過原始菌和突變菌對葡萄糖和木糖代謝的內部流量分析,更加清晰地探究了其發酵過程中各個路徑的代謝和流量走向,為以后流量的進一步控制奠定堅實基礎。

3 結論

原始酵母菌對木糖的利用率一直較低,大量的生物質原料得不到充分利用造成嚴重浪費。本文對熱帶假絲酵母進行誘變篩選,獲得一株能利用木糖發酵的菌株:熱帶假絲酵母 CICC1779-T70-2。通過對原始菌和突變菌發酵成分指標檢測對比分析可知,原始菌株對木糖的利用率僅為55.8%,而突變菌株的木糖利用率為92.2%;突變菌發酵產生的乙醇濃度最高可達22.85 g/L,而原始菌乙醇的產量最終只有17.58 g/L。進而對突變菌代謝機理深入研究,構建酵母菌代謝網絡并建立方程,對其代謝流量進行分析可知,原始菌不能有效代謝木糖是由于其缺乏木桐糖酶,無法將木糖轉化為木糖醇,戊糖磷酸途徑無法順利進行,突變菌可以提供木桐糖酶,保證了戊糖磷酸途徑的順利進行,提高了突變菌株對木糖的利用率,增加了乙醇的產率。本文深入探究分析酵母菌對五碳糖和六碳糖的共代謝,為后續的放大生產奠定了理論基礎。