六株人源益生菌的表面性質與黏附性能研究

熊世進,高文功,楊菲菲,趙雪婷,秦小彤,杜同浩,熊 濤,*

(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330047; 2.南昌大學食品學院,江西南昌 330031; 3.修益升益生菌國際研究院,香港 999077)

益生菌是攝入足夠的量時會對宿主產生諸多健康益處的一類活的微生物[1]。研究發現,益生菌對多種疾病包括炎癥性腸病、腸應激綜合征、急性腹瀉、高血壓、糖尿病和便秘等都具有預防或緩解作用[2]。富含益生菌的功能性食品具有抗癌、降血糖、抗氧化以及免疫調節等多種生物活性作用[3]。研究表明益生菌通過黏附作用定植于宿主腸上皮細胞(intestinal epithelial cells,IECs),逐步形成生物膜并產生多種代謝產物,從而構成一層天然的保護屏障,對宿主產生多種生理功效。對于外源的益生菌制劑來說,能否在腸道黏附和定植是評價其效果的主要指標之一[4]。因此,益生菌黏附并定植于宿主腸上皮細胞上是發揮其益生作用的前提。

益生菌對宿主IECs黏附作用可大致分為兩個過程。第一步是可逆的非特異性黏附,此階段是細菌趨近于宿主細胞的過程,主要由靜電力、疏水相互作用、空間位阻、范德華力和溫度等物理化學參數決定;第二步則是由分子介導的細菌表面特異性黏附素與宿主細胞表面特異性受體之間的結合,該過程一般是不可逆的[5]。益生菌對宿主IECs的黏附是由多種因素共同作用的結果,概括起來可分為內因和外因。內因主要指細菌的生理狀態、生長階段、菌體濃度、細胞壁組成等;外因主要是指一些環境條件,包括離子濃度(Ca2+、Mg2+等)、pH、溫度等[5]。此外,一些研究認為，細菌疏水性和自凝集作用在細菌對宿主細胞的黏附過程中起著重要作用，甚至與細菌的黏附呈一定的相關性[6-7]。

細菌的自凝集在生物膜的形成中起著重要作用,而且有助于益生菌在腸道的定植并防止致病菌的黏附[8];它是物理和化學因素相互作用的結果,其作用機制目前還不是十分清楚;大而重的菌體細胞會沉降的更快,但細胞表面電荷和表面組分是影響自凝集主要因素[9]。

細菌表面疏水性(cell surface hydrophobicity,CSH)被定義為表面具有非極性成分的細菌在具有極性性質的水中所表現出的非穩態,從而引起非穩態體系中的熱能和分子的重新排列[10]。研究表明,益生菌對腸上皮細胞的黏附是通過強疏水相互作用參與的一個過程,菌株表現出強的表面疏水性有助于黏附的發生[11]。當疏水率>60%時,菌株被認為是高度疏水的,當疏水率40%～60%時,菌株被認為是中度疏水的,當疏水率<40%時菌株是親水的[12]。

國內外學者通常只采用某一種細胞模型考察益生菌的黏附性或只通過自凝集和疏水性間接反映益生菌黏附性。益生菌的黏附存在宿主細胞特異性,自凝集和疏水性與黏附性間的相關性尚存在一定的爭議,因此本實驗意在探討益生菌的自凝集能力、疏水性及細胞黏附能力之間的相關性。由于體內黏附實驗的開展較為困難,現廣泛采用HT-29、Caco-2和HT-29-MTX等體外細胞黏附模型來近似模擬宿主體內益生菌的黏附定植情況[13]。本研究同時采用人結腸癌細胞系HT-29和Caco-2作為體外模型并結合益生菌的疏水性及自凝集特性考察六株益生菌的黏附能力;同時以HT-29細胞作為體外模型,探究不同因素對發酵乳桿菌CECT5716黏附能力的影響,從而更為全面地考察益生菌的黏附能力及影響其黏附能力的因素,為其在食品、藥品和保健品等行業中的應用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

發酵乳桿菌CECT5716、副干酪乳桿菌MP-137、鼠李糖乳桿菌MP-108、嗜酸乳桿菌F-1、乳雙歧桿菌AD011和長雙歧桿菌BLI-02 修益升益生菌國際研究院;人結腸癌細胞系HT-29 南昌大學前湖醫學院饋贈;人結腸癌細胞系Caco-2 南昌大學國家重點實驗室保存;DMEM培養液、1×PBS緩沖液(phosphate buffered saline,pH7.2)、優級胎牛血清 賽澳美細胞技術(北京)有限公司;胰蛋白酶-EDTA消化液 北京索萊寶科技有限公司;二甲苯 天津大茂化學試劑廠。

YXQ-LS-50SⅡ/75SⅡ立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;DWS-DG250厭氧工作站 華粵行儀器有限公司;CO2培養箱 長沙長錦科技有限公司;生物安全柜 蘇凈集團安泰公司;DNP-9272型生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;Thermo-ST16R高速冷凍離心機 賽默飛世爾(中國)科技有限公司;37XC倒置生物顯微鏡 上海光學儀器進出口有限公司;Olympus-CX31正置光學生物顯微鏡 上海維翰光電科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養液的配制及用途 DMEM不完全培養液(含1%谷氨酰胺)用于益生菌與結腸癌細胞系的黏附實驗;DMEM完全培養液(含有1%青霉素和鏈霉素、1%谷氨酰胺、1%的非必需氨基酸以及10%優質胎牛血清)用于HT-29及Caco-2細胞的常規培養;MRS培養基用于乳桿菌的培養;改良MRS培養基(補充有0.05%的L-半胱氨酸鹽酸鹽)用于雙歧桿菌的培養。

1.2.2 微生物的培養與保存 六株益生菌菌粉在相應MRS液體培養基37 ℃培養15 h,連續活化三次后在相應MRS平板上進行劃線,37 ℃厭氧培養48～72 h,觀察并記錄菌落形態,進行革蘭氏染色。所有菌種均取對數期菌懸液500 μL和50%的滅菌甘油按1∶1 (v/v)保存于-80 ℃下。

1.2.3 人結腸癌細胞的培養 將HT-29和Caco-2細胞凍存管從液氮罐中取出,于水浴鍋中迅速融化后,分別置于50 mL 25 cm2培養瓶中,各加入5 mL新鮮DMEM完全培養基,在二氧化碳培養箱中(95%空氣和5% CO2)37 ℃下培養,待細胞生長狀態良好后(約70%～80%融合),用胰蛋白酶-EDTA消化液消化傳代[14-15]。通常HT-29細胞每天換液,隔天傳代;Caco-2細胞隔天換液,每4 d傳代一次。

1.2.4 菌懸液制備 六株益生菌活化后挑取單菌落分別于相應MRS液體培養基37 ℃培養12～14 h作為種子液,再以2%(v/v)的接種量接種于50 mL MRS液體培養基中37 ℃過夜培養,室溫4500 r/min離心10 min收集菌體,無菌PBS緩沖液洗滌兩次后重懸,以乳酸菌活菌計數法[16]快速測定菌懸液中菌體數量,最后使用無菌PBS調整至所需菌體濃度。

1.2.5 自凝集能力的測定 將過夜培養的益生菌在室溫4500 r/min下離心10 min收集菌體,并用無菌PBS緩沖液洗滌兩次。隨后,將獲得的菌體細胞用無菌PBS重懸并調整A600至0.6±0.05(A0),在37 ℃孵育24 h。在第2、4、6、12和24 h時取上層菌懸液,于600 nm下測定吸光度(At),每次測定三個平行[17-18]。按照下式計算細菌的自凝集百分比。

其中:A0表示菌體初始吸光值,At代表t時刻上層菌懸液的吸光值。

1.2.6 疏水性測定 根據Bautista-Gallego等[19]的方法并略作改動。利用微生物黏著碳氫化合物法(bacteria adhesion to hydrocarbons,BATH)進行益生菌表面疏水性的測定。首先將過夜培養的益生菌在4500 r/min下離心10 min收集菌體細胞,并用無菌PBS緩沖液洗滌兩次;隨后,將獲得的菌體細胞用無菌PBS重懸并調整A600至0.6±0.05(A0)。然后取1 mL二甲苯加入至3 mL調整好濃度的菌體細胞懸液中,混合后在室溫下預孵育10 min,渦旋振蕩2 min,然后在室溫下孵育30 min分層,小心吸取水相,以無菌PBS為空白測定A600值(A)。按下式計算細菌的疏水性：

其中:A0表示菌體初始吸光值;A為二甲苯處理后下層水相吸光值。

1.2.7 益生菌對模擬腸上皮細胞的黏附性 將培養好的HT-29或Caco-2細胞用胰酶-EDTA消化液消化,再用DMEM完全培養液調整細胞濃度為1.0×105個/mL,裝于6孔組織培養板中,每孔2 mL,于CO2培養箱(5% CO2、95%空氣)中37 ℃孵育至細胞長至單層。棄去組織培養板中各孔的DMEM培養液,以無菌PBS緩沖液清洗培養板2遍,其中1孔用0.4 mL胰酶-EDTA消化液進行消化后,加入0.6 mL PBS緩沖液,用巴氏吸管吹打,將細胞完全消化并使之混合均勻,采用血球計數板計算細胞濃度。其他5孔分別加入1 mL DMEM不完全培養液、1 mL益生菌菌懸液(108CFU/mL),用移液槍吹打混勻,于37 ℃孵育2 h。孵育后棄去組織培養板中各孔的混合液,用無菌PBS緩沖液洗滌5次,以除去未黏附的菌體。加入0.4 mL胰酶-EDTA消化液進行消化后加入0.6 mL無菌PBS緩沖液,進行梯度稀釋,涂布于MRS固體平板上計算黏附的細菌數[14,20]。黏附能力用下式計算：

鑒于發酵乳桿菌CECT5716已經是被廣泛認可的優良益生菌株,它具有極大的實際應用價值,并綜合考慮六株益生菌的表面性質和黏附特性的實驗結果,選擇發酵乳桿菌CECT5716進行黏附能力影響因素的考察。

1.2.8 不同因素對發酵乳桿菌CECT5716黏附能力的影響

1.2.8.1 生長階段對黏附能力的影響 分別取培養至對數期(16 h)、穩定期(24 h)和衰亡期(36 h)的發酵乳桿菌CECT5716發酵液,室溫離心收集菌體(4500 r/min,10 min),無菌PBS洗滌2次，并以該緩沖液調整菌體濃度至108CFU/mL,分別與HT-29細胞共孵育2.0 h,計算其黏附能力。

1.2.8.2 菌體濃度對黏附能力的影響 取培養至24 h的發酵乳桿菌CECT5716發酵液,離心收集菌體(4500 r/min,10 min),無菌PBS洗滌兩次并以該緩沖液調整菌體濃度至105、106、107、108、109CFU/mL,之后分別與HT-29細胞共孵育2.0 h,計算其黏附能力。

1.2.8.3 共孵育時間對發黏附能力的影響 取培養至24 h的發酵乳桿菌CECT5716發酵液,離心收集菌體(4500 r/min,10 min),無菌PBS洗滌兩次并以該緩沖液調整菌體濃度至108CFU/mL,分別與HT-29細胞共孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h,計算其黏附能力。

1.3 數據分析

2 結果與分析

2.1 菌落形態及鏡檢結果

如表1所示,六株益生菌均為革蘭氏陽性菌，菌體基本都呈桿狀，菌落形態各異。

表1 六株益生菌菌落形態及鏡檢結果Table 1 Colony morphology and microscopic observation results of six probiotics

2.2 益生菌的自凝集能力

由圖2可知,六株益生菌的自凝集率隨孵育時間的延長而增加,在24 h時達到最大值,此時嗜酸乳桿菌F-1的自凝集率最高,為69.92%,這可能與其菌體較大有關;其次是長雙歧桿菌BLI-02,達62.43%,鼠李糖乳桿菌MP-108、乳雙歧桿菌AD011、副干酪乳桿菌MP-137和發酵乳桿菌CECT5716的自凝集率分別為51.14%、55.43%、53.40%和43.55%。此外,發酵乳桿菌CECT5716在前2 h內快速凝集,而其余五株菌主要在前6 h內迅速凝集。不同的益生菌在24 h時自凝集率存在顯著性差異(p<0.05),表明益生菌的自凝集作用具有菌種特異性,這也與其他研究人員[21-23]結論相一致。

圖1 六株益生菌的革蘭氏染色(1000×), Fig.1 Gram staining of six probiotics(1000×)注:A:發酵乳桿菌CECT5716;B:嗜酸乳桿菌F-1;C:鼠李糖乳桿菌MP-108; D:長雙歧桿菌BLI-02;E:乳雙歧桿菌AD011;F:副干酪乳桿菌MP-137。

圖2 益生菌在2、4、6、12和24 h后的自凝集率Fig.2 Auto-aggregation percentages of the probiotics after 2,4,6,12 and 24 h注:不同的字母表示各組間存在顯著差異(p<0.05),圖3～圖7同。

2.3 益生菌的疏水性

六株益生菌疏水性大小如圖3所示,其中疏水性最強的是鼠李糖乳桿菌MP-108,達到90.10%;其次則是乳雙歧桿菌AD011和嗜酸乳桿菌F-1,其疏水率分別達81.18%和76.82%;發酵乳桿菌CECT5716、副干酪乳桿菌MP-137和長雙歧桿菌BLI-02的疏水率分別為65.41%、27.10%、和1.83%,其中鼠李糖乳桿菌MP-108、乳雙歧桿菌AD011、嗜酸乳桿菌F-1和發酵乳桿菌CECT5716的疏水率大于60%,可被認為是高度疏水性菌株,而且除乳雙歧桿菌AD011與嗜酸乳桿菌F-1間疏水性大小不存在顯著性差異(p<0.05),其余菌株間均存在顯著差異(p<0.05),同樣表明益生菌株的疏水性具有菌種特異性,這與Saini等[21]、Oh等[24]研究結果,具有一致性。

圖3 不同益生菌的疏水性大小Fig.3 Hydrophobicity of the different probiotics

2.4 益生菌對不同結腸癌細胞的黏附能力

益生菌對腸上皮細胞的黏附是其在宿主體內發揮多種生理功能的重要基礎,也是篩選益生菌的一個首要考慮因素[25]。益生菌對Caco-2細胞的黏附性如圖4所示,乳雙歧桿菌AD011顯示出最高的黏附能力,為(42.80±0.68) CFU/cell;其次是副干酪乳桿菌MP-137和鼠李糖乳桿菌MP-108,分別達到(19.30±2.03)、(16.69±0.70) CFU/cell;其余三株菌對Caco-2細胞的黏附性較低(均低于1 CFU/cell),發酵乳桿菌CECT5716為(0.27±0.02) CFU/cell、嗜酸乳桿菌F-1為(0.50±0.10) CFU/cell、長雙歧桿菌 BLI-02為(0.27±0.03) CFU/cell,而且這三株菌之間無顯著差異(p>0.05)。陳臣[26]研究了4株乳桿菌對Caco-2細胞的黏附性,其中鼠李糖乳桿菌GG為(16.11±1.57) CFU/cell,低于本研究中乳雙歧桿菌AD011、副干酪乳桿菌 MP-137和鼠李糖乳桿菌MP-108的黏附能力。

圖4 不同益生菌對Caco-2和HT-29細胞的黏附性大小Fig.4 Adhesion to Caco-2 and HT-29 cells of the different probiotics

如圖4所示,六株益生菌對HT-29細胞的平均黏附能力分布在1.95～47.01 CFU/cell之間,其中以乳雙歧桿菌AD011的黏附性最強,為(47.01±0.20) CFU/cell;其次是長雙歧桿菌BLI-02,黏附能力達(33.57±0.82) CFU/cell;嗜酸乳桿菌F-1、副干酪乳桿菌MP-137、發酵乳桿菌CECT5716以及鼠李糖乳桿菌MP-108對HT-29細胞的黏附能力分別為(6.12±0.53)、(6.30±0.68)、(3.61±0.20)和(1.95±0.29) CFU/cell。魏銀萍等[27]研究了培菲康制劑中3種益生菌對HT-29細胞的黏附能力,結果顯示嗜酸乳桿菌、長雙歧桿菌和糞腸球菌的平均黏附能力分別約為5.01、4.41和1.63 CFU/cell,低于本研究中的乳雙歧桿菌AD011、長雙歧桿菌BLI-02、嗜酸乳桿菌 F-1和副干酪乳桿菌MP-137的黏附性。

不同的益生菌對HT-29細胞以及Caco-2細胞顯示出差異化的黏附能力,說明益生菌對結腸癌細胞的黏附存在菌種特異性,這也與諸多研究[9,22,28]中的結論相符。此外,同一菌株對不同結腸癌細胞的黏附能力同樣具有明顯差異,如長雙歧桿菌BLI-02對HT-29細胞黏附能力達(33.57±0.82) CFU/cell,而對Caco-2的黏附只有(0.27±0.03) CFU/cell,鼠李糖乳桿菌MP-108對HT-29和Caco-2細胞黏附能力分別為(1.95±0.29)、(19.30±2.03) CFU/cell。Ribeiro等[29]的研究表明植物乳桿菌L2C21E8和L3C1E8對Caco-2細胞的黏附性要明顯強于對HT-29;類似地,Lazado等[18]在考察潛在益生菌株GP21和 GP12對鱈魚不同腸段細胞的黏附性時發現,菌株GP12傾向于粘附前腸和中腸段細胞,菌株GP21則更傾向于黏附后腸段細胞,均表明益生菌對宿主細胞的黏附存在宿主特異性。

2.5 不同因素對發酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細胞的影響

2.5.1 生長階段對黏附能力的影響 分別取培養時間為16 h(對數期)、24 h(穩定期)以及36 h(衰亡期)的發酵乳桿菌CECT5716菌懸液進行黏附實驗,其結果如圖5。當培養時間為16 h時,發酵乳桿菌CECT5716的黏附能力顯著低于培養時間為24 h的黏附能力(p<0.05);達到穩定期24 h時,其黏附能力達到最大,為(3.61±0.20) CFU/cell。可以推測菌體處于穩定期階段時,細胞開始大量合成并分泌黏附素或與其相關的物質至細胞外,而且此階段菌體細胞的表面性質比較穩定,從而表現為黏附能力顯著提高。而達到衰亡期時,其黏附能力大幅度減小(p<0.05),可能是由于衰亡期的菌體形態退化造成菌體表面性質的變化或者外界環境因子的變化破壞了黏附素的結構,從而造成黏附能力的大幅度降低。

圖5 生長階段對發酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細胞的影響Fig.5 Effect of growth stages on the adherence of Lactobacillus fermentum CECT5716 on HT-29 cells

2.5.2 菌體濃度對黏附能力的影響 由圖6可知,當黏附實驗所使用的發酵乳桿菌CECT5716菌體濃度低于108CFU/mL時,黏附能力隨菌體濃度的增大而顯著增加(p<0.05);當菌體濃度達到1×109CFU/mL時,與菌體濃度108CFU/mL相比，黏附能力的增加不再顯著(p>0.05),黏附達到飽和狀態。可能是由于宿主細胞表面特異性結合位點的數量是有限的,當菌體濃度達到一定數量后,這些結合位點大部分已經與細菌表面的黏附素發生特異性結合,所以即使再加大菌體濃度,黏附能力不再顯著增加。

圖6 菌體濃度對發酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細胞的影響Fig.6 Effects of cell concentration on the adherence of Lactobacillus fermentum CECT5716 to HT-29 cells

2.5.3 共孵育時間對黏附能力的影響 將制備好的發酵乳桿菌CECT5716菌懸液(108CFU/mL)與HT-29細胞分別共孵育0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h后,梯度稀釋平板計數黏附能力,其結果見圖7。發酵乳桿菌CECT5716與HT-29細胞共孵育時間小于2 h時,黏附能力隨共孵育時間的延長而顯著增加(p<0.05),當孵育時間超過2 h后,其黏附能力不再顯著增加(p>0.05)。可以推測出發酵乳桿菌CECT5716對HT-29細胞的黏附過程達到飽和存在時間上的依賴關系,即隨著共孵育時間的延長,HT-29細胞表面特異性受體與黏附素的結合已經達到飽和,故黏附能力在共孵育2 h后不再增加。

圖7 共孵育時間對發酵乳桿菌CECT5716黏附HT-29細胞的影響Fig.7 Effects of incubation time on the adhesion of Lactobacillus fermentum CECT5716 to HT-29 cells

2.6 益生菌表面性質與黏附能力間的關系

益生菌自凝集率、疏水率及黏附能力間的關系如圖8所示,它們之間的變化并沒有出現明顯的規律性;統計學分析的結果(表2)也證明它們無顯著的相關性。益生菌的黏附性與表面性質之間的關系,一直是一個具有爭議性的話題。一些研究人員[9,17,22]認為益生菌的黏附性與其表面性質(特別是表面疏水性)成正相關,但同時也有研究結果顯示它們之間并不存任何的相關性[24,30-31]。益生菌對宿主細胞的黏附是一個由多種因素介導的原核細胞與真核細胞間的相互作用過程。益生菌的疏水性和自凝集是其相關表面蛋白、糖類及其他化合物所賦予的一種物理化學特性。這種特性能使益生菌更容易趨近于宿主細胞，從而完成黏附過程的第一步;此外,這些化合物可能是黏附素的組成成分,從而使益生菌有更大的概率與細胞表面的特異性受體結合,所以益生菌具有的優良表面性能可能有助于其對宿主細胞的黏附。

圖8 益生菌的自凝集、疏水性及黏附能力的比較分析Fig.8 Comparative analysis of auto-aggregation, hydrophobicity and adhesion of probiotics

3 結論

本研究通過對六株人源益生菌的黏附性和表面性質的考察,發現乳雙歧桿菌AD011的綜合性能較好,其對Caco-2和HT-29細胞的黏附性分別為(42.80±0.68)、(47.01±0.20) CFU/cell,疏水性和24 h時的自凝集率分別為81.18%和55.43%。此外,益生菌對HT-29細胞的黏附性隨菌體濃度的增大而顯著增加,當菌體濃度達到108CFU/mL時,黏附能力的增加不再顯著;處于穩定期生長階段的菌體黏附能力最強;隨著共孵育時間延長至2.0 h,黏附能力隨之達到穩定狀態,黏附過程存在時間依賴關系。益生菌的黏附性、疏水性及自凝集作用均存在菌種特異性;此外,同一益生菌對不同結腸癌細胞表現出黏附性的差異,說明益生菌的黏附作用也存在宿主的特異性;益生菌自凝集率、疏水率及黏附能力間無顯著相關性。

實驗證明六株人源益生菌的表面性質與黏附性能之間無顯著相關,在評價益生菌的黏附性或篩選高黏附性益生菌時需要進行各項黏附指標綜合的考量。此外,乳雙歧桿菌AD011在各方面都表現出較好的性能,具備在人體腸道良好的潛在定植能力,在食品、藥品和保健品等行業中具有良好的應用前景。