同步糖化淀粉質原料高產L蘋果酸菌株的選育

黃寶琪,左正三,宋 萍,*,李姝姝,黃 飛,黃 和

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 211816; 2.南京北盛榮能源科技有限公司,江蘇南京 211178; 3.南京工業大學藥學院,江蘇南京 211816)

蘋果酸又名2-羥基丁二酸,是一種重要的C4有機酸,是生物體內三羧酸循環的成員之一,廣泛存在于水果和蔬菜中[1]。L-蘋果酸具有明顯的呈味作用,其酸味柔和、爽快、刺激性緩慢、保留時間長,與檸檬酸配合使用,可以模擬天然果實的酸味特征,是高檔飲料和嬰幼兒食品首選酸味劑,廣泛應用于食品行業[2]。在醫藥上,L-蘋果酸可直接參與人體代謝,對人體健康有益,另外在印染、化工、燃料及其他工業,L-蘋果酸都具有廣闊的應用前景[3]。

三種蘋果酸的大規模合成方法中,化學合成和生物酶法所用原料是石化產品,不符合可持續發展的要求。基于此,微生物發酵合成法是目前最有發展前景的蘋果酸合成方法。微生物發酵合成法生產的L-蘋果酸安全性能較高,市場需求量大,并且逐年增高。世界目前蘋果酸的生產總量超過100000噸,而L-蘋果酸產量約為總產量的40%[4],而未來蘋果酸的使用需求量預計每年超過200000噸。

與能通過微生物發酵法大量合成的檸檬酸相比,L-蘋果酸的生物合成存在菌種少、產量低和底物耐受性差等缺點[5-6]。因此要通過微生物發酵合成法生產L-蘋果酸，需要選育或改造現有菌株，以獲得高產蘋果酸菌株。可用作蘋果酸的生產菌包括細菌、酵母和霉菌,而目前高產蘋果酸菌種的選育于構建也主要集中在這幾類菌種上。

霉菌是最早用于蘋果酸生產的菌株,其中黃曲霉具有較高生產水平,天然產生蘋果酸作為發酵的主要產物[7],通過培養基成分和發酵條件的優化,蘋果酸的得率和產量分別能夠達到1.28 mol/mol葡萄糖和113 g/L[8]。然而,由于其具有生產基因毒性和致癌性黃曲霉毒素的潛力,不適用于工業規模發酵[9]。之后,人們將目光轉向其他菌株,米曲霉是經美國FDA認證的安全菌株,相對于傳統的蘋果酸生產菌株——黃曲霉而言,米曲霉因不存在對人體及動物有致癌作用的黃曲霉毒素,而受到工業界的青睞。

近年來,更多的科研工作者利用代謝工程的手段來改造非天然生產菌株來生產蘋果酸,主要包括兩個模式微生物大腸桿菌和釀酒酵母。Moon等[10]通過代謝通量分析的方法發現PEP羧化途徑的增強能夠提高蘋果酸的產量,使得在好氧條件下蘋果酸的產量達到9.25 g/L;Zelle等[11]通過三種代謝工程策略來優化菌株,在以葡萄糖為碳源的分批培養中,通過代謝工程改造的菌株能夠產生59 g/L蘋果酸,得率為0.42 mol/mol葡萄糖。但是,蘋果酸的產量仍舊很低,不適于工業化生產。

目前發酵法生產L-蘋果酸的主要原料為葡萄糖[12],原料費占蘋果酸生產的很大一部分;因此,為了降低發酵法生產蘋果酸的成本,提高其競爭力,選擇低廉淀粉質原料是生物法制備L-蘋果酸的出路[13-14],篩選能高效利用粗淀粉質原料——脫胚玉米粉合成蘋果酸的菌株是很有應用價值的。

本研究選取AspergillusoryzaeME303為出發菌株,采用離子注入誘變,以2-脫氧葡萄糖(2-DG)篩選壓力誘變到多株遺傳性能穩定2-DG抗性菌株,通過比較原始菌株和誘變菌株的糖化酶活力和代謝特征獲得一株糖化酶活最高的L-蘋果酸生產菌株。研究有助于獲得利用脫胚玉米粉發酵生產蘋果酸的突變菌株,對粗淀粉質原料資源的高值化利用和蘋果酸合成新工藝的開發具有重要的理論和現實意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

脫胚玉米淀粉 滕州市魯金玉米加工有限公司;1.9×105U/mL葡萄糖化酶 中糧生化有限公司(中國蚌埠);實驗試劑 均為分析級試劑,國藥集團化學試劑有限公司;標準品L-蘋果酸 Sigma公司;米曲霉(A. oryzae ME303) 本實驗室石蠟凍存菌,是一株蘋果酸生產菌;培養基配方:馬鈴薯葡萄糖瓊脂(Potato dextrose agar,PDA)斜面培養基(g/L):馬鈴薯(去皮)200,蔗糖20.0,瓊脂15～20;種子培養基(g/L):C6H12O6·H2O 40,NaCl 0.005,KH2PO40.75,K2HPO4·3H2O 0.98,CaCl20.075,(NH4)2SO44,FeSO4·7H2O 0.005,MgSO4·7H2O 0.1,滅菌前滴加3～4滴濃硫酸;2-DG選擇性固體培養基(g/L):2-DG 0.2,甘油40,(NH4)2SO44,KH2PO40.75,K2HPO4·3H2O 0.98,NaCl 0.005,CaCl20.75,MgSO4·7H2O 0.1,FeSO4·7H2O 0.005,瓊脂20;可溶性淀粉發酵培養基(g/L):可溶性淀粉80,(NH4)2SO41.2,K2HPO40.1,K2HPO4·3H2O 0.17,MgSO4·7H2O 0.1,FeSO4·7H2O 0.06,CaCO390.0[15]。

SPX-70BⅢ型恒溫生化培養箱 上海精密實驗設備有限公司;DK-8D型水浴鍋(控溫精度±0.1 ℃) 北京天林恒泰科技有限公司;ARTP-Ⅱ型ARTP誘變育種機 無錫源清天木生物科技有限公司;SW-CJ型超凈臺工作臺 蘇州凈化設備有限公司;HYG-A全溫搖瓶柜 江蘇太倉實業設備廠;BS 124S型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;LEICA DMC2900顯微鏡 上海貿易有限公司;GZX-9140MBE型電熱鼓風干燥箱 上海博迅實業有限公司醫療設備廠;戴安P680高效液相色譜儀 美國安捷倫。

1.2 實驗方法

1.2.1 誘變處理

1.2.1.1 孢子懸浮液的制備 將A.oryzaeME303接種在PDA斜面培養基上,在30 ℃條件下培養168 h,孢子成熟后,用一定量的無菌水洗脫斜面培養基中的孢子,經無菌脫脂棉過濾去除菌絲體后,制備成孢子懸浮液,控制孢子懸浮液濃度為107～108個/mL,4 ℃冰箱保存備用。

1.2.1.2 脫胚玉米淀粉液化液的制備 脫胚玉米粉與水以8%～12%(w/v)的比例混合成糊狀后,加熱到70 ℃,加入耐高溫淀粉酶,加酶量為800 U/g,保溫10 min后繼續加熱到90 ℃,碘檢不變色后繼續加熱到100 ℃煮沸5～10 min,冷卻后待用。

1.2.1.3 大氣室溫等離子體(ARTP)誘變條件的確定 無菌水洗脫孢子配制成107個/mL的孢子懸浮液,取1 mL于試管內,從中取0.1 mL孢子懸浮液均勻涂布于滅過菌的空白培養皿中,無菌條件下室溫風干。然后將這些孢子培養皿放入誘變機內,靶室抽真空至10-3Pa,選用15 KeV N+,50×1013～300×1013/cm2劑量,對這些孢子在不同條件下進行誘變處理:功率設置為:100 W,處理時間設置為:90、120、150、180、210、240 s;功率設置為:120 W,處理時間設置為:90、150、210 s。然后取出培養皿,以1 mL無菌水洗脫,調整孢子濃度為106個/mL,涂布于種子培養基,30 ℃條件下培養17 h計數,計算致死率(3個重復的平均值)[16],沒有誘變處理的孢子懸浮液配制成106個/mL作為對照,選取3個致死率最高的條件對孢子進行誘變處理。

1.2.2 抗2-DG突變株的篩選方法

1.2.2.1 平板初篩 取100 μL經過離子注入后(方法見1.2.1.3)所得孢子懸浮液,涂布于2-DG-甘油選擇性固體培養基30 ℃條件下培養72 h,將能夠長出的菌落轉移到PDA斜面上30 ℃條件下培養168 h。為了篩選出穩定的2-DG抗性株,把這些突變株接種于2-DG-甘油選擇性固體培養基上,再次能夠在此選擇培養基正常生長的菌落接種轉接至PDA斜面上,30 ℃條件下培養168 h后置于4 ℃冰箱保藏[17]。為了驗證這些突變株是否是2-DG抗性菌株,把篩選到的菌株的孢子接種于2-DG-葡萄糖選擇性固體培養基30 ℃條件下培養216 h,使用顯微鏡觀察,以能否產孢子作為判斷標準。最后篩選出能夠在2-DG-甘油選擇性固體培養基上生長,且在2-DG選擇性固體培養基上產孢菌落的為抗2-DG突變株,并進行分離純化[18]。

1.2.2.2 搖瓶復篩 平板初篩的單菌株活化后,以10%的接種量(v/v)接入發酵培養基中,于30 ℃、150 r/min條件下進行搖瓶培養,8000 r/min離心15 min后取發酵上清液進行L-蘋果酸測定,檢測上述平板長出的菌株是否為L-蘋果酸產生菌。

1.2.2.3 2-DG對出發菌株最低抑制濃度的測定 制備2-DG系列濃度梯度平板,濃度為:0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 g/L;取0.1 mL孢子懸液涂布于平板上,30 ℃培養觀察確定其對出發菌株生長的抑制濃度。

1.2.3 突變株的穩定性實驗 將所篩選的突變株接入PDA培養基中,連續傳代七次,30 ℃、150 r/min條件下發酵191 h,測定每次傳代后菌株發酵后L-蘋果酸的產量,觀察其遺傳穩定性。

1.2.4 突變株的發酵 搖瓶發酵,每隔24 h取樣測定總殘糖、蘋果酸及發酵過程中糖化酶酶活變化。

1.2.5 糖化酶活力的測定

1.2.5.1 待測酶液的制備 稱取葡萄糖化酶粉2 g,精確至0.0002 g,用少量的乙酸緩沖液溶解,并用玻璃棒搗研,將上清液傾倒入容量瓶中。沉渣部分再加入少量緩沖液,如此搗研3～4次,最后全部移入容量瓶中,用緩沖液定容至100 mL刻度(酶活力在100～250 U/mL范圍內),搖勻。通過4層紗布過濾,濾液供測定用。

1.2.5.2 樣品測定 底物為2%的脫胚玉米淀粉液化液,用50 mmol/L、pH4.6的醋酸緩沖液新鮮配制。取A、B兩支5 mL離心管,分別加入2%的脫胚玉米淀粉液化液1 mL于(40±0.2) ℃的恒溫水浴中預熱5 min。在B管中加入待測酶液0.08 mL,立即計時,搖勻。在此溫度下準確反應30 min后,立即向A、B管中各加入200 g/L的氫氧化鈉溶液8 μL,搖勻,同時將兩管取出,迅速用水冷卻,并于A管中補加待測酶0.08 mL,作為空白對照。吸取上述A、B兩管中的反應液采用二硝基水楊酸(DNS)測糖。1 mL液體酶,于40 ℃、pH4.6的條件下,1 h分解可溶性淀粉產生1 mg葡萄糖所需的酶量,即為一個酶活力單位,以U/mL表示。

1.2.6 費林法測定總殘糖量

1.2.6.1 樣品前處理 取樣品(液化液或發酵液)10 mL置于250 mL的三角瓶中,加蒸餾水至100 mL,并加入7.5 mL濃硫酸,搖勻,于馬弗爐上加熱沸騰10 min后冷卻,再用濃NaOH調節pH至中性,定容至500 mL,待測。

1.2.6.2 樣品測定 取費林甲乙液(費林甲液:15 g無水硫酸銅加0.05 g次甲基藍溶于蒸餾水中,配成1000 mL溶液;費林乙液:50 g酒石酸鉀鈉加54 g氫氧化鈉,4 g黃血鹽(亞鐵氰化鉀)溶于蒸餾水中配成1000 mL溶液)各5 mL于100 mL三角瓶中,取2 mL處理好的樣品于該三角瓶中,加適量標準葡萄糖溶液,加熱至沸騰,保持沸騰狀態以免空氣中氧的干擾,以4～5 s/滴的速度滴加葡萄糖溶液,直至藍色消失,測定所耗葡萄糖量即為液化液或發酵液中總殘糖量,5%標準葡萄糖溶液作空白對照。

總糖(%)=(V空白-V樣品)×0.1%×稀釋倍數

1.2.7 L-蘋果酸的檢測 發酵液預處理在發酵液中加入適量的6 mol/L鹽酸,中和發酵液中過量的碳酸鈣、蘋果酸鈣等鈣鹽,80 ℃水浴至發酵液澄清,趁熱抽濾,定容至10 mL,用0.22 μm濾膜過濾,留樣備用。

HPLC測定條件：戴安P680,Chromeleon工作站,BIO-RAD Aminex HPX-87H,300 mm×7.8 mm,9 μm,流速0.8 mL/min,進樣量20 μL,流動相,5 mmol H2SO4,pH2.5,柱溫65 ℃。A. oryzae ME303作為對照。

1.2.8 數據處理 所有實驗均有三個平行樣,三個數據點用于計算標準偏差,用誤差線表示,依據相應的計算公式,并利用Origin 8.5繪制出圖,并進行相應的數據分析。

2 結果與分析

2.1 誘變條件的確定

以A.oryzaeME303為原始出發菌株進行ARTP誘變,在誘變過程中(圖1),ARTP離子注入100 W處理180 s會殺死77%的菌體;100 W處理210 s會殺死97%的菌體;120 W處理210 s會殺死94%的菌體。突變本身具有隨機性,其致死率和正突變之間的關系并不是十分清楚,主要取決于誘變方法和菌株本身的特性。較低的致死率不利于發生突變,致死率在80%～95%的時候,正突變率最高[19],故選用100 W 180 s、100 W 210 s、120 W 210 s三個致死率條件對這些孢子進行處理。

圖1 不同誘變條件對A. oryzae ME303的致死率Fig.1 Mortality of A. oryzae ME303 under different mutagenic conditions

2.2 2-DG對出發菌株最低抑制濃度(MIC)的測定

2-DG是葡萄糖這一分解代謝物的結構類似物,也會阻遏誘導酶的合成。由于細胞能把2-DG像葡萄糖一樣地攝入,卻不能分解,而積累于細胞內。因此2-DG對微生物具有致死或抑菌作用。

選用在甘油作為單一碳源培養基中加入不同濃度2-DG的平板,來確定2-DG對原始菌株A.oryzaeME303最低生長抑制濃度(表1),在2-DG-甘油選擇性固體培養基上A.oryzaeME303生長和不生長的界限非常明顯,在2-DG濃度為1.0 g/L時,A.oryzaeME303幾乎不生長,因此選用2-DG對出發菌株最低抑制濃度是1.0 g/L,優化過后的2-DG選擇性固體培養基中2-DG濃度即1.0 g/L。

表1 不同2-DG濃度對A. oryzae生長的影響Table 1 Effects of different 2-DG concentrations on growth of A. oryzae

2.3 從2-DG抗性菌株中篩選高產蘋果酸的菌株

經過一次獨立2-DG平板的篩選,共得到80株2-DG抗性菌株,在80株中,只有46株菌株在PDA上傳代五次以后還能2-DG平板上生長,而在這僅剩的46株中,只有15株能夠在2-GD平板上產生孢子,因此認為這15株突變株為2-DG抗性菌株。將這15株突變株編號為SS1,SS2,…,SS15,連續在含有0.8 g/L的2-DG的平板上傳代培養10代,來檢測其遺傳穩定性,其中10株突變菌株都能夠正常生長,結果表明它們具有針對2-DG抗性突變的穩定性。

將10株抗性菌株與原始菌株在不對脫胚玉米淀粉質原料進行糖化預處理的情況下,直接利用脫胚玉米淀粉液化液來生產L-蘋果酸并進行了比較(圖2)。可看出,在這10突變株中,產L-蘋果酸濃度最低為26 g/L,平均濃度為30.5 g/L,SS3具有最高蘋果酸產量為38 g/L,與平均值差別較大，且為僅有的一株超過35 g/L的突變株,因此被選為以同步糖化淀粉質為原料的高產蘋果酸抗2-DG的突變菌株。

圖2 10株突變株以脫胚玉米淀粉>液化液為原料的蘋果酸產量Fig.2 Malic Acid production of 10 mutants using corn starch Liquor as raw material

對菌株SS3進行7代傳代發酵試驗(圖3),在PDA斜面上傳代,考察SS3在脫胚玉米淀粉液化液中發酵的穩定性,7代傳代中,突變株SS3的蘋果酸產量均在40 g/L以上,平均值為42 g/L,在第五代時達到最高濃度為44 g/L,保持了較好的發酵穩定性;在第四代、第五代的蘋果酸產量較高,說明發酵產物不隨傳代次數的增多而下降,SS3是一株可高產蘋果酸且具有傳代穩定性的菌株。

圖3 A. oryzae SS3 7代傳代發酵穩定性考察Fig.3 Study on the stability of A. oryzaeSS3 7 generation fermentation

2.4 高產蘋果酸突變株的發酵特性考察

突變株A.oryzaeSS3發酵進行191 h后(圖4),蘋果酸產量達41.39 g/L,生產速度為0.22 g/L/h,與A.oryzaeME303對照(33.98 g/L,0.18 g/L/h)相比產量提高了21.80%,產率提高了22.20%。Brown等[20]發現在氮饑餓條件下A.oryzaeNRRL3488可積累30.27 g/L L-蘋果酸,比突變株A.oryzaeSS3產量少11.12 g/L;Deng等[21]以玉米淀粉作為碳源時,A.oryzaeDG-3同步糖化發酵產富馬酸39.8 g/L,可見A.oryzaeDG-3的糖轉換率和產酸量均低于A.oryzaeSS3。因此,可以看出A.oryzaeSS3為一株可高產產蘋果酸突變株。

圖4 A. oryzae ME303和SS3菌株搖瓶 培養產L-蘋果酸過程曲線Fig.4 Malic acid production process curve of shaking flask culture of A. oryzae ME303 and SS3 strains

在突變菌株米曲霉的發酵過程中,糖化酶表現出較高的活力,在96 h時比活達到最大,為320.0 U/mL,與對照菌株相比(220.0 U/mL),該酶的活力增加了45.45%,而且,突變株的耗糖速率比原始菌株A.oryzaeME303快。Anuradha Ghosh等[22]通過利用紫外線、NTG等對土曲霉進行物理和化學混合誘變,利用含2-DG平板進行篩選,選育得到一株抗分解代謝阻遏的突變株,使糖化酶酶活力提高了1.8倍。Pardeep Kumar等[23]使用亞硝酸、60 Co誘變Thermomucor indicae-seudaticae,在含0.5 g/L的2-DG查氏平板上篩選到了一株突變株,其糖化酶活力比出發菌株提高了1.8倍。Nakamura等[24]已報道導入糖化酶基因的重組酵母菌的淀粉發酵消耗速率與糖化酶活力水平直接相關。因此,可以推斷出可能由于突變株A.oryzaeSS3具有更高的糖化酶酶活力,能快速淀粉糊精為菌體代謝提供足夠的葡萄糖,從而使得整個發酵過程葡萄糖到蘋果酸的轉化率得到提高。

3 結論

本文在不添加商品糖化酶的情況下,利用ARTP誘變提高粗淀粉質原料生產蘋果酸,分離出2-DG抗性的突變體,以提高糖化酶的活性。利用突變體A.oryzaeSS3,發酵191 h,從脫胚玉米粉(總糖80 g/L)中成功地獲得了41.39 g/L蘋果酸,生產速度0.22 g/L/h,比原始菌株提高了21.80%;本研究中突變體SS3中具有較高的糖化酶活力,為320.0 U/mL,比原始菌株增加了45.45%,這是一株具有較高產率和酶活的菌株,為目前報道米曲霉利用淀粉質原料生產蘋果酸、酶活性的較高水平。

突變體A.oryzaeSS3在傳代實驗中證明該菌株產酸性能穩定,為從粗淀粉原料中高效發酵蘋果酸開辟了一條新途徑。ARTP誘變育種方法可快速有效地誘變A.oryzae,且突變效果良好,本研究通過2-DG抗性A.oryzae的篩選提高了其糖化酶活力,實現無需另外添加商品糖化酶就能同步糖化發酵淀粉質原料制備蘋果酸的新工藝。此工藝的開發為更高效、更低成本利用粗淀粉質原料生產蘋果酸提供了新思路。A.oryzaeSS3是一支具有工業開發價值的較優菌株,培養及優化、發酵工藝條件及下游工程的配套技術有待進一步研究。