雙孢蘑菇貯藏保鮮過程中菇體表面的菌相變化

李 婕,黃琳翔,詹藝舒,褚秀丹,肖淑霞,陳炳智,3,江玉姬,3,*

(1.福建農林大學食品科學學院,福建福州 350002; 2.福建省食用菌技術推廣總站,福建福州 350002; 3.福建農林大學菌物研究中心,福建福州 350002)

雙孢蘑菇Agaricusbisporus(J.E. Lange)Imbach是世界上栽培最廣、產量最多的一種食用菌[1],其顏色潔白,味道鮮美,具有較高的營養價值和保健效果。因為雙孢蘑菇含水量較多、呼吸速率高,難以貯藏保鮮,極易褐變和發生由微生物引起的腐爛現象[2],限制了雙孢蘑菇的鮮銷,因此,雙孢蘑菇貯藏期間的品質變化及其保藏方法研究尤為重要。李靜[3]和李云云[4]等分別采用低溫下二氧化碳、乙醇熏蒸和低鹽真空處理對雙孢蘑菇進行保鮮試驗,結果表明:雙孢蘑菇的保鮮期均有所延長。目前研究主要集中于雙孢蘑菇的褐變機理及采后保鮮技術,而對保鮮過程中微生物菌相變化的研究則未見報道。

長期以來,研究者們大都以微生物的傳統純培養為基礎,從各種食品中分離純化鑒定了多種微生物[5]。但是由于培養基質和培養條件的限制,通過傳統的純培養方法分離純化出來的微生物,卻僅占環境中微生物的極小部分[6]。隨著現代測序技術的普及,高通量測序技術已成功應用于土壤多樣化[7]、海洋食品[8]和腸道環境[9]、發酵食品[10]等多個學科領域,可檢測到食品中更多的微生物群落,及時了解時空演替規律,其中16S rRNA高通量測序技術目前已廣泛應用于食品微生物生態學領域[11]。劉延波等[12]通過Miseq測序平臺對濃香型白酒中溫曲和高溫曲進行高通量測序分析,鑒定出不同類型酒曲中的特殊細菌,建立了一套分析濃香型白酒大曲細菌群落結構的高通量測序方法。Park等[13]在10種泡菜的發酵過程中定期收集了100份樣品,采用16S rRNA測序技術對影響泡菜生態系統生物多樣性的因素進行分析,結果表明:每種泡菜的種類和制作工藝不同,相應的細菌群落多樣性和豐富程度有所不同。本研究將傳統的微生物分離培養法與宏基因組(16S rRNA基因)測序技術相結合,測定雙孢蘑菇在4 ℃貯藏保鮮條件下的表面微生物群落的變化和優勢菌,為雙孢蘑菇的保鮮提供參考數據和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮雙孢蘑菇 采自福建省長樂市鶴上鎮新覽村希爾帆食用菌工程技術研究中心;LB固體培養基(蛋白胨、酵母膏粉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂) 廣東環凱微生物科技有限公司。

BIORAD S1000 Thermal Cycler PCR儀 美國Bio-Rad公司;DYY-12C型電泳儀 北京六一儀器廠;SPX-80A-JB型恒溫生化培養箱 上海一恒實業有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將當天新鮮采摘的雙孢蘑菇進行分揀,挑選菇體完整、顏色潔白、未開傘、無病蟲害、無機械傷、子實體大小基本一致的雙孢蘑菇隨機分成4組,每組80±5.0 g,置于4 ℃生化培養箱內保鮮,從第0 d開始,每4 d取一次樣,編號分別為S0、S1、S2、S3。采樣原則、采樣方案參照GB/T 4789.1-2010《食品衛生微生物學檢驗總則》。

1.2.2 平板分離 將不同保鮮時期的雙孢蘑菇表面組織切塊(約1 cm×1 cm),稱取25.0 g于無菌袋中,加入225.0 mL蛋白胨水,均勻振蕩30 s,獲得外源細菌的洗脫液,制備10倍系列稀釋樣品勻液,取100 μL稀釋液均勻涂布到LB固體培養基上,置于37 ℃培養箱中培養24 h。觀察菌落形態特征,挑取不同形態特征的菌落進行2～3次分離純化,純化后的菌株保存于試管斜面,備用。顯微鏡檢其形態以及革蘭氏染色。

1.2.3 PCR擴增與測序 用接種環依次挑取每個純培養后的菌株,于裝有10 μL滅菌蛋白胨水的離心管內制備菌懸液作為DNA模板,利用細菌16S rRNA擴增通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進行PCR擴增。PCR擴增采用30 μL體系:DNA模板1 μL、10×Buffer 3 μL、dNTPs 2 μL、上下游引物各1 μL、rTaq酶0.3 μL、滅菌雙蒸水22 μL。PCR擴增條件:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,50 ℃ 30 s,72 ℃ 1.5 min,35個循環,72 ℃ 10 min,4 ℃保存。PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,檢測到目標條帶后,將PCR產物送于上海生工生物有限公司進行測序。將得到的序列在NCBI上進行BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對,找到相似度最高的菌種。

1.2.4 Illumina Miseq高通量測序分析 雙孢蘑菇樣品在干冰條件下送至上海生工生物公司,提取菇體表面DNA,針對16S rRNA基因V3～V4區,合成帶有barcode的特異引物。利用341F(5′-CCTACGGG NGGCWGCAG-3′)和805R(5′-GACTACHVGGG TATCTAATCC-3′)引物進行PCR擴增,采用MiSeq平臺進行測序分析,將測序得到的原始序列進行篩選,丟棄長度短于200 bp、對低復雜度的序列進行過濾,得到質量較高、符合要求的有效序列。

1.3 數據處理

將各樣本序列進行質量控制過濾后,對有效數據在97%水平上進行操作分類單元(operational taxonomic units,OTU)聚類,并利用Greengenes數據庫對OTU進行分類信息分析,分析樣品物種組成。利Mothur軟件進行Alpha多樣性和基于加權Unifrac算法進行主成分分析(principal component analysis,PCA)。利用 RDP classifier軟件對各樣品中OTU依次進行門(Phylum)、綱(Class)、目(Order)、科(Family)、屬(Genus)分類信息分析。

2 結果與分析

2.1 貯藏時間對菇體表面細菌總數的影響

不同貯藏時間對雙孢蘑菇菇體表面的細菌總數測定結果見表1,可以看出,新鮮采收的雙孢蘑菇表面菌落總數較高,并且隨著貯藏時間的延長,菌落總數呈上升趨勢,貯藏至第12 d時菇體表面菌落總數達到1.44×105CFU/g,同時菇體發生嚴重褐變、發粘、異味現象,失去商品價值。

表1 貯藏時間對雙孢蘑菇表面細菌總數的影響Table 1 Effects of storage time on the total colony number of bacteria on ABFB

2.2 雙孢蘑菇表面菌相變化分析

2.2.1 雙孢蘑菇表面可培養細菌分析 采用傳統平板分離培養方法共分離到36個菌株。擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,結果見圖1,擴增產物電泳條帶均明亮單一,大小約1800 bp,為目標產物,可用于后續測序。

圖1 雙孢蘑菇可培養細菌PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of culturable bacteria from ABFB

測序結果進行BLAST比對和分析,其中鑒定出4個相同菌株,合并后為33個菌種,隸屬于4個門,分別為厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)和細菌門(Bacteriophyta);屬于21個菌屬,分別是微小桿菌屬(Exiguobacterium)、芽胞桿菌屬(Bacillus)、節桿菌屬(Arthrobacter)、乳球菌屬(Lactococcus)、拉烏爾菌屬(Raoultella)、賴氏菌屬(Leifsonia)、微桿菌屬(Microbacterium)、根瘤菌屬(Rhizobium)、壤霉菌屬(Agromyces)、束毛球菌屬(Trichococcus)、考克氏菌屬(Kocuria)、短狀桿菌屬(Brachybacterium)、節細菌屬(Arthrobacter)、纖維菌屬(Cellulosimicrobium)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、叢毛單胞菌屬(Comamonas)、無色桿菌屬(Achromobacter)、Chryseomicrobium屬、動性球菌屬(Planococcus)、西地西菌屬(Cedecea)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。

鑒定分離出棒桿狀菌株19個,球狀菌株14個;革蘭氏陽性菌株有28個,革蘭氏陰性僅有5株,菌株編號為2、3、22、24和26號5個菌株鑒定出有芽孢,結果見表2。

表2 雙孢蘑菇貯藏過程中的可培養細菌的組成及生物學特性Table 2 Composition and biological characteristics of culturable bacteria from ABFB during storage

2.2.2 高通量測序分析 由表3和表4可以看出,測序有效數據率在92%以上,可用于后續分析。各組Chao1和Ace指數數值近似,表明各樣本中物種數均較為豐富,物種數由大到小為S3、S0、S2、S1,即細菌物種種類最豐富的為貯藏保鮮12 d的雙孢蘑菇,物種種類最稀少為貯藏4 d的雙孢蘑菇。文庫覆蓋度Goods coverage均大于0.978,顯示測序對樣本中細菌的覆蓋率很高，測序深度適合，注釋結果可以反映樣品中細菌豐富度的真實情況。根據各組樣品Chao1和Ace指數,4 ℃低溫下保鮮的雙孢蘑菇隨貯藏時間增加菌群結構發生了明顯變化,細菌群落豐度有所增加。

表3 雙孢蘑菇中細菌高通量測序結果統計Table 3 Statistics of high-throughput sequencing of bacteria from ABFB

表4 雙孢蘑菇中細菌高通量測序結果的α多樣性指數Table 4 Alpha diversity indices of high throughput sequencing results of bacteria from ABFB

Alpha多樣性分析蘑菇表面細菌豐度和多樣性,圖2為4個樣品的Shannon稀疏曲線與主成分分析(PCA)圖,可分別表示樣品測序數據的準確性和不同樣品間可能表現出分散和聚集的分布情況,其中PCA分析圖通過分析不同樣品的OTU(97%相似性)組成,運用方差分解,將多組數據的差異反映在二維坐標圖上,樣本組成越相似,其反映在PCA圖中的距離越近。

圖2(A)圖中可以看出,4個不同貯藏保鮮時間的雙孢蘑菇樣品的Shannon稀疏曲線趨于平坦,表明測序數據量足夠大,可反映樣本中絕大多數微生物信息,隨測序量增加，新的菌系不會被發現,微生物多樣性也不會發生變化。圖2(B)表明:PCA1和PCA2分別在樣品差異性貢獻率上達到72%和19%,合計達到91%,是差異的主要來源。圖2(B)圖中樣品S0和S1距離最近,均位于PCA1和PCA2的負值區域,說明二者細菌群落的相似度較高;S2與S0和S1相近性次之,同樣位于兩坐標軸的負值區域,說明三個樣品之間的主成分變異不顯著;樣品S3與其他樣品的距離較遠,細菌群落組相似度相對較低。所以,在4 ℃條件下,不同保鮮貯藏時間的雙孢蘑菇細菌群落分布發生顯著變化。

圖2 雙孢蘑菇細菌高通量測序Shannon-Wiener曲線和主成分分析圖Fig.2 Shannon-Wiener curve and principal component analysis for high throughput sequencing of bacteria from ABFB

圖3可直觀展現雙孢蘑菇樣品表面細菌群落基因測序的OTU數目組成相似性及重疊情況。4個不同貯藏保鮮時間的雙孢蘑菇樣品測序共獲得OTU為17666個,S0、S1、S2和S3四個樣品特有的OUT序列數分別為3790、3112、4912和3338。S0與S1重疊的OTU序列數最多為1469個,顯示這兩個樣品之間的菌群相似度最高。

圖3 不同貯藏時間的雙孢蘑菇細菌高通量測序韋恩圖Fig.3 Venn diagram of high-throughput sequencing of bacteria from ABFB at different storage time

2.3 貯藏期間雙孢蘑菇表面細菌群落結構及動態變化

2.3.1 雙孢蘑菇基于門水平的微生物群落結構分析 圖4是基于門繪制的微生物群落結構變化圖,對各樣品中的OTU依次進行門、綱、目、科、屬的分類信息分析,一共獲得30個門的細菌。其中Proteobacteria、Actinobacteria、Bacteroidetes、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Firmicutes的微生物種類占比最高。

圖5 雙孢蘑菇基于屬水平的細菌分析圖Fig.5 Frequencies of different genus bacteria from ABFB

隨貯藏時間的延長,基于門的微生物群落結構發生了變化。雙孢蘑菇在4 ℃貯藏保鮮期間Proteobacteria豐度顯著增加,在新鮮采摘的雙孢蘑菇中Proteobacteria豐度為50.02%,貯藏4 d時上升為58.09%,到第12 d時達到64.33%,成為優勢腐敗菌;Verrucomicrobia和Actinobacteria豐度變化小;Bacteroidetes豐度逐漸下降,從11.18%(0 d)下降至7.74%(4 d),進一步降至6.81%(14 d)。Planctomycetes和Firmicutes所有樣品中所占比例較小且變化規律相同,均隨貯藏時間延長而下降。Planctomycetes豐度值為11.18%,至樣品貯藏終點時減少至6.81%;Firmicutes豐度值則從7.29%下降至1.48%。由此可知,雙孢蘑菇在4 ℃條件下低溫貯藏保鮮可以抑制Bacteroidetes和Firmicutes生長,但對Planctomycetes和Actinobacteria的抑制作用不明顯。

2.3.2 雙孢蘑菇基于屬水平的微生物群落結構分析 除去無法歸類和其他的菌屬,共檢測到48個屬的細菌,其中Pseudomonas、德沃斯氏菌屬Devosia、Arthrobacter、布丘氏菌屬Buttiauxella、Rhizobium為占比例前5的屬。采摘的雙孢蘑菇(S0)中檢測到19個屬的細菌,其中Devosia為主要微生物,占到8.79%,貯藏保鮮12 d時下降到4.59%;Pseudomonas則從保鮮第4 d的1.26%,在貯藏第12 d時上升到24.48%,成為優勢菌屬。

3 討論

本試驗通過利用傳統微生物分離培養方法,從4 ℃保鮮貯藏條件下的雙孢蘑菇中共分離純化出4個門21個屬中的33種細菌,而采用16S rRNA高通量測序共獲得30個門48個菌屬的細菌。柯莉娜等[14]從腐爛的雙孢蘑菇中分離鑒定到6株細菌,分別為2株黏質沙雷氏菌(Serratiamarcescens)、產酸克雷伯菌(Klebsiellaoxytoca)、不動桿菌屬(Acinetobacterguillouiae)、沙雷氏菌屬(Serratiasp.)和阿氏腸桿菌(Enterobacterasouriae)。上述報道的試驗結果與本試驗的研究結果有所些不同,可能與雙孢蘑菇的產地、種植環境、流通環節等差異有關。王瓊英等[15]以金針菇、杏鮑菇、蟹味菇鮮品為材料,采用高通量測序的方法分析貨架期內其外源細菌數量及群落多樣性的變化。結果表明:金針菇貨架期外源細菌群落結構中相對豐度最高的屬分別為乳球菌屬,杏鮑菇和蟹味菇的優勢菌屬則是假單胞菌屬,三種食用菌在貨架期內外源細菌數量明顯增加,外源細菌種類及相對豐度在貨架期呈動態變化,說明不同食用菌在貯藏過程中,主要的優勢菌不同。而Leff等[16]利用16S rRNA高通量測序技術對包括雙孢蘑菇在內的11種果蔬進行表面的菌相變化研究,結果表明:雙孢蘑菇表面假單胞菌OTU數量最多,占比約11.3%,說明假單胞菌是雙孢蘑菇的優勢腐敗菌。Tarlak等[17]研究溫度對雙孢蘑菇切片中假單胞菌生長動力學的影響,發現蘑菇切片的L值與假單胞菌的數量有關,當假單胞菌的數量達到109CFU/g時,L值約為80,雙孢蘑菇切片失去商品價值,這些研究結果與本試驗結果一致,均表明假單胞菌是雙孢蘑菇貯藏保鮮過程中的主要優勢菌和致腐菌。

4 結論

本試驗通過傳統微生物平板培養方法,從4 ℃保鮮貯藏下的雙孢蘑菇中共分離純化出4個門21個屬的33個種的細菌,結果表明:新鮮采收的雙孢蘑菇表面菌落總數較高,并且隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢;而采用高通量測序分析共獲得30個門48個屬的細菌,根據Shannon、Chao1、Ace指數和Alpha多樣性分析,結果表明:4 ℃低溫下保鮮的雙孢蘑菇隨貯藏時間增加菌群結構發生了顯著變化,細菌群落豐度有所增加,不同保鮮貯藏時間的雙孢蘑菇細菌群落分布顯著變化;Exiguobacterium、Rhizobium、Arthrobacter、Trichococcus、Staphylococcus和Pseudomonas6個屬細菌在上述兩種方法中均被分離檢測出來,且Pseudomonasspp.為雙孢蘑菇貯藏保鮮過程中的主要致腐菌。盡管高通量測序方法應用于食品中存在的微生物分類和鑒定會更加全面準確,但是傳統的分離培養方法也分離鑒定出了一些高通量測序未能檢測出的特有的菌屬,如解鳥氨酸拉烏爾菌(Raoultellaornithinolytica)、乳酸鏈球菌(Lactococcuslactissubsp.)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissubsp.)。本文將上述兩種方法相結合,對雙孢蘑菇表面細菌的群落組成、相對豐富度以及多樣性進行了分析,可以更加全面地掌握雙孢蘑菇在貯藏保鮮過程中的微生物種類和變化動態,為延長雙孢蘑菇的貯藏保鮮期以及雙孢蘑菇的腐敗變制質機理的進一步研究提供了理論依據。