不同菌種發(fā)酵對辣木莖葉粉的營養(yǎng)價值及其抗氧化活性的影響

石鴻輝,苑廣偉,廖正睿,郭 霖,李 悅,王 磊,陳曉陽，*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院,廣東廣州 510642; 2.廣東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(木本飼料)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510642; 3.廣東省木本飼料工程技術(shù)研發(fā)中心,廣東廣州 510642; 4. 廣東省森林植物種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東廣州 510642；5.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)材料與能源學(xué)院,廣東廣州 510642)

辣木(MoringaoleiferaLam.)作為一種快速生長的多用途植物,生物量大,營養(yǎng)價值高,通常可以長到12 m左右,廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)[1-2]。據(jù)報道[3],辣木的根、葉、皮、種子、花和豆莢都是可食用的。其中,辣木葉富含多種對人類和畜禽機(jī)體有益的活性成分,能夠有效治療多種疾病或器官異常,比如心臟異常、胃腸道異常、腹水、風(fēng)濕[4]、炎癥、肝腎功能紊亂和血液疾病[5]等。但是,辣木葉常常因色澤、氣味、口感等原因不受消費(fèi)者喜愛。而且辣木葉含有一些有害物質(zhì)、生物堿以及植物毒素,這些物質(zhì)一般指辣木堿、單寧、皂苷、植酸、氰苷、硫代葡萄糖苷等[6],當(dāng)其攝入過量時,可能具有神經(jīng)麻痹或其他毒副作用[7-8]。

基于上述特性,尋找一種能夠有效改善辣木葉營養(yǎng)品質(zhì)的處理手段尤為重要。固態(tài)發(fā)酵是指利用微生物在潮濕的沒有自由流動水的固體基質(zhì)上生長代謝的技術(shù)[9]。在食品或飼料行業(yè)中,黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌等益生菌的應(yīng)用較為廣泛。黑曲霉酶系發(fā)達(dá),能夠分泌纖維素酶、果膠酶、蛋白酶、淀粉酶等多種酶,可以將纖維素、淀粉等大分子降解為小分子單糖,供自身和其他微生物生長所需。產(chǎn)朊假絲酵母易與其他菌種協(xié)同發(fā)酵,自身的菌體蛋白含量高達(dá)50%,富含維生素B族元素和氨基酸等營養(yǎng)成分,常用于生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白。而枯草芽孢桿菌同樣能分泌纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等多種酶,而且能夠產(chǎn)生豐富的代謝產(chǎn)物,改善風(fēng)味,提高適口性[10]。但是,微生物固態(tài)發(fā)酵辣木葉的研究鮮有報道。Thierry等人[11]的研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌A6發(fā)酵辣木葉粉不僅可以提高蛋白含量、體外蛋白消化率以及可供利用的鐵含量,還可以降低植酸鹽的含量。

本研究主要以辣木莖葉粉作為基質(zhì),探討黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌單一或者混合發(fā)酵對辣木莖葉粉營養(yǎng)成分、抗?fàn)I養(yǎng)因子及抗氧化活性的影響,旨在為增強(qiáng)辣木飼料或食品的營養(yǎng)價值提供新的方法和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

辣木(MoringaoleiferaLam.)莖葉粉 由廣東省湛江市徐聞縣辣木種植專業(yè)合作社提供;黑曲霉GIM 3.576(Aspergillusniger,A)、枯草芽孢桿菌GIM 1.427(Bacillussubtilis,B) 購自廣東省微生物菌種保藏中心;產(chǎn)朊假絲酵母CICC 31188(Candidautilis,C) 購自中國工業(yè)微生物菌種保藏中心;蘆丁、單寧酸、植酸鈉、薯蕷皂苷元、無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品 上海源葉生物科技有限公司;可溶性糖試劑盒、總抗氧化能力試劑盒 蘇州科銘有限公司;胰蛋白酶(250 U/mg)、胃蛋白酶(3000 U/mg)、氯霉素 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)、2,2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid),ABTS) 美國sigma公司;PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基 均由實(shí)驗(yàn)室配制;3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、三氯化鋁、氯化亞鐵、香草醛、磷酸等 均為分析純。

Vaioskan LUx連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀 美國賽默飛世爾科技公司;SB-5200D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝;CU600B水浴鍋 上海福瑪;DHP-9162恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒;Optima xPN-100超高速冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特;ZWY-240恒溫?fù)u床 上海智城;K9860全自動凱氏定氮儀 濟(jì)南海能;Ankom A200i型半自動纖維分析儀 美國ANKOM公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化和微生物種子液的制備 菌種活化:將保藏完好的黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母分別接種于PDA斜面培養(yǎng)基上,于28 ℃恒溫培養(yǎng)3 d,將枯草芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基下30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)24 h。

微生物種子液的制備:黑曲霉用PDA固體培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)至菌絲鋪滿整個培養(yǎng)皿,用適量無菌水沖洗孢子,4層擦鏡紙過濾后,通過血球計(jì)數(shù)板計(jì)算并調(diào)節(jié)孢子懸液的濃度為1×107CFU/mL。產(chǎn)朊假絲酵母用PDA液體培養(yǎng)基28 ℃,150 r/min搖瓶培養(yǎng)3 d,測定濃度約為1×108CFU/mL,而枯草芽孢桿菌用LB培養(yǎng)基30 ℃,250 r/min培養(yǎng)48 h,用無菌水稀釋濃度約為1×108CFU/mL。

1.2.2 辣木莖葉粉固態(tài)發(fā)酵的制備 稱取40 g辣木莖葉粉作為發(fā)酵基質(zhì),分別以12%(v/w)的接種量添加黑曲霉(A)、枯草芽孢桿菌(B)和產(chǎn)朊假絲酵母(C),同時將這三種菌兩兩組合,按12%(v/w)的總接種量加入雙菌組合(接種比例為1∶1)或三菌組合(接種比例為1∶1∶1)混合發(fā)酵,對照組則添加等量的無菌水,其他條件保持一樣,每24 h攪拌一次。以2∶3料水比在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵6 d后取樣。

1.2.3 發(fā)酵產(chǎn)物主要營養(yǎng)成分測定 粗蛋白含量的測定參照GB/T 6432-1994《飼料中粗蛋白測定方法》;酸溶蛋白含量的測定參照GB/T 22492-2008《大豆肽粉》;中性洗滌纖維(neutral detergent fiber,NDF)和酸性洗滌纖維(acid detergent fiber,ADF)含量的測定參照GB/T 20806-2006《飼料中中性洗滌纖維(NDF)的測定》和NY/T 1459-2007 《飼料中酸性洗滌纖維的測定》;還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸比色法[12]。

1.2.4 發(fā)酵產(chǎn)物體外蛋白消化率(invitroprotein digestibility,IVPD)的測定 體外蛋白消化率的方法參考文獻(xiàn)[13]報道,即準(zhǔn)確稱取1 g樣品于錐形瓶中,加入25 mL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L,pH6.0),混勻后向其中加入10 mL 0.2 mol/L HCl,并用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至2,然后向該混合物中加入1 mL含有10 mg胃蛋白酶的新鮮制備的胃蛋白酶溶液。為了防止細(xì)菌生長,加入0.5 mL氯霉素溶液。封口后置于39 ℃搖床中溫和振蕩6 h。然后向混合物加入10 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L,pH6.8)和5 mL 0.6 mol/L NaOH溶液,再用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH溶液將pH調(diào)節(jié)至6.8,最后加入1 mL胰酶溶液(含有50 mg胰酶),封好口,放入39 ℃搖床中恒溫振蕩18 h。消化結(jié)束后,向所有錐形瓶中加入5 mL 20%磺基水楊酸,室溫下靜置30 min,使溶解但未被消化的蛋白質(zhì)沉淀出來。然后將未消化的殘余物收集于布氏漏斗中,用去離子水反復(fù)沖洗三角瓶,直至殘余物完全轉(zhuǎn)移。將未消化的殘余物在80 ℃下干燥過夜,然后測定未消化的蛋白質(zhì)含量,通過以下公式計(jì)算體外蛋白消化率(invitroprotein digestibility,IVPD)。

IVPD(%)=(樣品粗蛋白含量-殘余物粗蛋白含量)/樣品粗蛋白含量×100

1.2.5 抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的測定 參考Makkar報道[14],采用Folin-Ciocalteu法測定總酚、水解單寧和縮合單寧含量。根據(jù)Leone等[15]描述的方法測定植酸鹽含量,皂苷含量的測定參考賈秀峰等[16]和Hiai等人[17]文獻(xiàn),稱取發(fā)酵后的辣木莖葉粉2 g,置于100 mL錐形瓶中,加入30 mL 80%甲醇溶液,置于微波爐中,低火連續(xù)加熱3 min,靜置至室溫,得到提取液。吸取0.2 mL提取液,加入0.2 mL香草醛-冰醋酸,1.0 mL高氯酸,密封搖勻,70 ℃水浴30 min后,冰浴10 min中止反應(yīng),加冰醋酸至10 mL,空白試劑作為對照,于540 nm處測定吸光度,皂苷含量以薯蕷皂苷元當(dāng)量(diosgenin equivalent,DE)表示。總酚、水解單寧含量以單寧酸當(dāng)量(tannic acid equivalent,TAE)表示,單位均是g/kg,以干物質(zhì)計(jì)。

1.2.6 抗氧化活性的測定

1.2.6.1 黃酮含量的測定 參考文獻(xiàn)[18]描述,稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,用80%甲醇溶解,定容至50.0 mL。準(zhǔn)確移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別于10 mL容量瓶中,各加入5%亞硝酸鈉0.3 mL,搖勻靜置10 min后,各加入10%三氯化鋁溶液0.3 mL,搖勻靜置10 min后再加入1 mol/L NaOH 2 mL,分別用80%甲醇稀釋至10 mL,靜置10 min后于510 nm測吸光度,以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品黃酮含量測定準(zhǔn)確移取各甲醇提取液5 mL于10 mL容量瓶中,按上述繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行操作,由回歸方程計(jì)算試液中的總黃酮含量。總黃酮含量用蘆丁當(dāng)量(rutin equivalent,RE)表示,以干物質(zhì)計(jì)。

1.2.6.2 總抗氧化能力的測定 參照文獻(xiàn)[19]的亞鐵還原能力(FRAP)法,在酸性環(huán)境中,還原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)產(chǎn)生藍(lán)色的Fe2+-TPTZ的能力反應(yīng)了總抗氧化能力。本試驗(yàn)中采用總抗氧化能力(total antioxidant capacity,T-AOC)試劑盒檢測,于593 nm處測定吸光值。

1.2.6.3 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻(xiàn)[20]的方法,準(zhǔn)確稱取DPPH粉末0.0394 g,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成濃度為1 mmol/L DPPH溶液。測定時,用甲醇稀釋10倍,配制成0.1 mmol/L反應(yīng)液。取0.5 mL樣品提取液,加入2.0 mL 0. 1 mmol/L DPPH反應(yīng)液混合均勻。將混合液放在暗處不斷振蕩30 min,于517 nm下測定吸光值。空白對照組用甲醇代替樣品液,樣品對照組以甲醇代替DPPH反應(yīng)液。樣品的DPPH自由基清除能力按如下公式計(jì)算:

式中:Ao為對照組吸光值;Ax為樣品吸光值;Axo為樣品對照組吸光值。

1.2.6.4 ABTS自由基清除能力的測定 參考文獻(xiàn)[21]報道,將5 mL ABTS(7 mmol/L)和88 μL過硫酸鉀(40 mmol/L)充分混勻后,室溫下避光放置12～16 h以便形成ABTS自由基儲備液。做試驗(yàn)前,用無水乙醇將ABTS自由基儲備液稀釋,要求該溶液在30 ℃,734 nm處吸光值為0.70±0.02(用乙醇調(diào)零)。測定時,將0.5 mL樣品液與4 mL ABTS自由基溶液混合均勻,室溫下靜置6 min,于734 nm條件下測定吸光值。空白對照組用乙醇代替樣品溶液,樣品對照組以無水乙醇代替ABTS自由基溶液。樣品的ABTS自由基清除能力按如下公式:

式中:Ao為對照組吸光值;Ax為樣品吸光值;Axo為樣品對照組吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵產(chǎn)物的營養(yǎng)成分及體外蛋白消化率

發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白、酸溶蛋白、還原糖含量和體外蛋白消化率如表1所示,對照組的辣木莖葉粉粗蛋白含量為19.84%(以干物質(zhì)計(jì),下同),不同菌種及其組合發(fā)酵均顯著提高了辣木莖葉粉的粗蛋白含量(p<0.05),黑曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母分別發(fā)酵后的辣木莖葉粉粗蛋白含量無顯著差異,但A+B、A+C以及A+B+C混菌組合發(fā)酵顯著優(yōu)于單一菌種發(fā)酵(p<0.05),尤其是黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵,粗蛋白含量高達(dá)29.29%,顯著高于兩菌組合發(fā)酵及單一菌種發(fā)酵(p<0.05)。這是因?yàn)樵诠虘B(tài)好氧發(fā)酵過程中,微生物的生長代謝消耗了大部分營養(yǎng)基質(zhì),干物質(zhì)總量在減少,同時黑曲霉、產(chǎn)朊假絲酵母等均能將辣木莖葉粉中的氮源轉(zhuǎn)化為菌體蛋白,使得蛋白質(zhì)的相對含量提高。

酸溶蛋白含量也是重要的營養(yǎng)指標(biāo),發(fā)酵過程中微生物會分泌多種蛋白酶,將大分子蛋白降解為易于吸收的小肽或氨基酸,而且微生物自身代謝也能合成氨基酸[22]。由表1可知,微生物發(fā)酵處理后的辣木莖葉粉酸溶蛋白含量均有所提高。但三菌混合發(fā)酵的效果最好,酸溶蛋白含量為9.97%,顯著高于對照組(p<0.05),這與曾李等[23]的研究相似。而黑曲霉和枯草芽孢桿菌發(fā)酵組的酸溶蛋白含量為8.08%,顯著高于其他雙菌組合(p<0.05),這說明黑曲霉和枯草芽孢桿菌,以及產(chǎn)朊假絲酵母共生培養(yǎng)可以產(chǎn)生更加全面的蛋白酶系,有利于大分子蛋白的降解。

另外,還原糖作為固態(tài)發(fā)酵過程中微生物生長代謝需要的重要碳源,能被微生物吸收利用。從表1可知,對照組的還原糖含量為0.70%。單一菌種發(fā)酵組的還原糖含量與對照組差異不顯著,原因可能是單一菌種在生長代謝的過程中會受到葡萄糖阻遏效應(yīng)的影響[24]。而混菌發(fā)酵后的還原糖含量均顯著低于對照組(p<0.05),特別是黑曲霉和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵組,以及枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵組,還原糖含量均為0.07%,顯著低于其他處理組(p<0.05)。這可能是因?yàn)楹谇埂⒖莶菅挎邨U菌產(chǎn)生的纖維素酶、淀粉酶等能將纖維素和淀粉等降解,產(chǎn)生的寡糖和單糖又被產(chǎn)朊假絲酵母利用,從而消除了葡萄糖阻遏效應(yīng)的影響。

表1 不同發(fā)酵處理下辣木莖葉粉營養(yǎng)成分及體外蛋白消化率的變化(%)Table 1 Changes of nutritional componentsand in vitro protein digestibility of Moringa oleifera stem and leaf powder under different fermentation treatments(%)

辣木莖葉粉由于存在含量較高的粗纖維,阻礙了消化酶與底物的充分接觸,導(dǎo)致內(nèi)在的營養(yǎng)物質(zhì)不能完全釋放,本研究中對照組的體外蛋白消化率只有14.34%。屈紅森等[25]用枯草芽孢桿菌發(fā)酵制備桑葉蛋白,發(fā)現(xiàn)蛋白的體外消化能力得到顯著提高。由表1可知,各發(fā)酵處理組均顯著提高了辣木莖葉粉的體外蛋白消化率(p<0.05),體外蛋白消化率最高的一組是A+B+C組,較對照組而言,提高了10.61%。微生物發(fā)酵的過程中不僅會降解大分子蛋白成小肽或氨基酸,而且產(chǎn)生的菌體蛋白更利于消化吸收。

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物的中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)含量

由圖1可知,黑曲霉(A)、枯草芽孢桿菌(B)單一菌種以及它們的菌種組合(A+B),甚至加上產(chǎn)朊假絲酵母(A+B+C)三菌混合發(fā)酵后的NDF和ADF含量均顯著低于對照組(p<0.05)。枯草芽孢桿菌單一菌種發(fā)酵后的辣木莖葉粉NDF和ADF含量均顯示最低,這說明在這樣的發(fā)酵條件下枯草芽孢桿菌能分泌較強(qiáng)的纖維素酶。而混菌發(fā)酵中,A+B組和A+B+C組的NDF含量比較低,A+B組和A+C組的ADF含量較低。綜合考慮,A+B組是降解辣木莖葉粉纖維含量最佳的組合。黑曲霉和枯草芽孢桿菌共生培養(yǎng)可能會產(chǎn)生更加全面的纖維素酶系統(tǒng)。

圖1 不同發(fā)酵處理對發(fā)酵產(chǎn)物的中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量的影響Fig.1 Effects of different fermentation treatments on the contents of neutral detergent fiber and acid detergent fiber of fermented products注:小寫字母不同表示差異顯著(p<0.05);圖2～圖5同。

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物的抗?fàn)I養(yǎng)因子含量變化

由表2可知,B組、A+B組、A+C組以及A+B+C組的總酚含量顯著高于對照組(p<0.05),黑曲霉和枯草芽孢桿菌組合發(fā)酵的總酚含量達(dá)到最高,說明黑曲霉和枯草芽孢桿菌共同發(fā)酵能夠提取更多的酚類物質(zhì)。

表2 發(fā)酵辣木莖葉粉抗?fàn)I養(yǎng)因子含量的變化Table 2 Changes in antinutritional factor contents of fermented Moringa oleifera stem and leaf powder

這與郭孝萱等[26]的研究結(jié)果相似。Cai等[27]認(rèn)為這可能是因?yàn)槲⑸锇l(fā)酵能將結(jié)合狀態(tài)的多酚釋放出來造成的。另外,不同處理組的辣木莖葉粉水解單寧含量均有所下降,黑曲霉發(fā)酵組、黑曲霉和其他菌種組合發(fā)酵的處理組(A、A+B、A+C、A+B+C組),水解單寧含量顯著低于對照組(p<0.05)。據(jù)文獻(xiàn)報道[28],單寧酶屬誘導(dǎo)酶,黑曲霉固態(tài)發(fā)酵能夠產(chǎn)生較高活力的單寧酶。各處理組的皂苷含量雖與對照組無顯著差異,但從表2可以看出,皂苷含量在發(fā)酵的過程中也在減少。對照組的植酸含量有55.15 g/kg,而Makkar等[29]報道的辣木葉植酸含量31 g/kg,這是因?yàn)楹醚醢l(fā)酵過程干物質(zhì)損失量大于降解植酸的含量而使得植酸的含量相對提高。黑曲霉單菌發(fā)酵組的植酸含量顯著低于枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母發(fā)酵組(p<0.05),而混菌發(fā)酵中A+B+C組的植酸含量最低,較對照組減少了8.24 g/kg。

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物的抗氧化活性

據(jù)報道,植物某些次生代謝產(chǎn)物如酚類,類黃酮具有重要的抗氧化活性[30]。酚類和類黃酮[31]等物質(zhì)能螯合機(jī)體內(nèi)的金屬離子,抑制自由基的產(chǎn)生。過多的活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)自由基會攻擊體內(nèi)的生物分子(蛋白、脂質(zhì)、DNA),導(dǎo)致細(xì)胞的死亡或組織的氧化損傷[32]。使用FRAP、DPPH和ABTS指標(biāo)可以監(jiān)測植物的抗氧化活性,它們抑制、清除以及阻礙活性氧(ROS)的形成,從而減少自由基產(chǎn)生的危害[33]。

由圖2可知,A組、B組、A+B組、A+C組和A+B+C組的總黃酮含量顯著高于對照組(p<0.05),這是因?yàn)楹谇埂⒖莶菅挎邨U菌均能分泌纖維素酶、果膠酶等,破壞了辣木莖葉粉的細(xì)胞壁成分,釋放了其中的內(nèi)容物,提高了類黃酮的提取率。其中黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵的效果最佳,黃酮含量高達(dá)863.80 mg/kg。

圖2 不同發(fā)酵處理對發(fā)酵產(chǎn)物黃酮含量的影響Fig.2 Influences of different fermentation treatments on flavonoid content of fermented products

由圖3可知,黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵組(A+B)的總抗氧化能力達(dá)到1402.40 U/g,顯著高于其他處理組(p<0.05)。另外,枯草芽孢桿菌單一菌種發(fā)酵比其他兩種菌表現(xiàn)出更高的抗氧化能力,產(chǎn)朊假絲酵母則表現(xiàn)出較低的總抗氧化能力。

圖3 不同發(fā)酵處理對發(fā)酵產(chǎn)物總抗氧化能力的影響Fig.3 Influences of different fermentation treatments on total antioxidant capacity of fermented products

氫自由基的清除是一個重要的抗氧化機(jī)制,DPPH具有氫自由基,它在電磁輻射的可見光區(qū)域產(chǎn)生強(qiáng)烈的517 nm吸收帶,隨著電子配對,這種吸收減少,DPPH溶液的紫色迅速消失[34]。由圖4可知,B組、A+B組、A+C組、A+B+C組的DPPH自由基清除率顯著高于對照組(p<0.05),分別是75.62%、83.79%、76.08%、79.07%。其中,A+B組的DPPH自由基清除率比對照組高了16.22%。

圖4 不同發(fā)酵處理對發(fā)酵產(chǎn)物DPPH自由基清除活性的影響Fig.4 Influences of different fermentation treatments on DPPH scavenging activity of fermented products

如圖5所示,枯草芽孢桿菌和黑曲霉發(fā)酵組的ABTS自由基清除率顯著高于對照組(p<0.05),分別是63.59%和58.94%。而且A+B、A+C以及A+B+C混菌發(fā)酵的ABTS自由基清除率均顯著高于單一菌種發(fā)酵組(p<0.05),A+B組的ABTS自由基清除率高達(dá)75.37%。

圖5 不同發(fā)酵處理對發(fā)酵產(chǎn)物ABTS自由基清除活性的影響Fig.5 Influences of different fermentation treatments on ABTS scavenging activity of fermented products

以上結(jié)果均說明,通過微生物固態(tài)發(fā)酵的方式能夠有效提高辣木莖葉粉的抗氧化活性。某些研究結(jié)果[35]表明抗氧化活性與酚類物質(zhì)含量、黃酮類物質(zhì)含量存在正相關(guān)的關(guān)系。本研究中發(fā)現(xiàn)黑曲霉和枯草芽孢桿菌混合發(fā)酵組的總酚含量和總黃酮含量均高于其他處理組,抗氧化活性指標(biāo)也同樣均高于其他處理組,這是因?yàn)楹谇购涂莶菅挎邨U菌均能分泌纖維素酶、蛋白酶等多種酶,將酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)從纖維素、蛋白質(zhì)或其他多聚物上釋放出來。混合發(fā)酵的效果更好可能是因?yàn)榛旌习l(fā)酵中,黑曲霉和枯草芽孢桿菌組成的酶系種類更全面,而產(chǎn)朊假絲酵母降解纖維的能力較低,所以本試驗(yàn)中C組的黃酮和酚類物質(zhì)含量較低,抗氧化活性也同樣較低。

3 討論

Nouman等人[36]認(rèn)為,辣木不同部分組成的不同混合物具有不同的營養(yǎng)價值,辣木的葉和枝條混合物具有較低的粗蛋白含量和較高的中性洗滌纖維含量。據(jù)報道[37],辣木莖葉粉含有19.5%的粗蛋白及23.7%的中性洗滌纖維。Zhang等[38]為了提高辣木葉粉的品質(zhì),改善辣木食品的營養(yǎng)特性,分別用里氏木霉CICC 2626、短小芽孢桿菌CICC 10440、枯草芽孢桿菌 CICC 21934以及地衣芽孢桿菌CICC 21942發(fā)酵辣木葉粉,結(jié)果發(fā)現(xiàn),用短小芽孢桿菌CICC 10440發(fā)酵辣木葉粉24 h后可溶性蛋白含量達(dá)到最大值(285 mg/g)。本研究比較了黑曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母單一菌種發(fā)酵和混菌組合發(fā)酵對辣木莖葉粉營養(yǎng)品質(zhì)的影響,發(fā)現(xiàn)混菌發(fā)酵優(yōu)于單一菌種發(fā)酵,這是因?yàn)閱尉l(fā)酵時微生物的代謝產(chǎn)物大量積累會反饋?zhàn)瓒粝嚓P(guān)酶類的合成,由于混菌發(fā)酵是一個生物混合體系,體系中的微生物之間大多具有生長代謝協(xié)調(diào)作用,某些微生物如酵母菌能夠利用這些代謝產(chǎn)物,從而解除這種反饋?zhàn)瓒簟alyani等人[39]發(fā)現(xiàn)不同真菌產(chǎn)生的酶系統(tǒng)可以相互補(bǔ)充并有利于形成木質(zhì)纖維素底物水解的完整纖維素酶系統(tǒng)。黑曲霉缺少內(nèi)切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶[40],本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)A+B組降解纖維的含量優(yōu)于其他處理組,說明黑曲霉和枯草芽孢桿菌共同培養(yǎng)能分泌比較完整的纖維素酶系統(tǒng),通過纖維素酶、果膠酶、木聚糖酶等多種酶的作用,破壞植物的細(xì)胞壁成分,有效釋放其中的活性成分,從而提高了植物的抗氧化活性,但陳江[41]發(fā)現(xiàn)不同菌種不同發(fā)酵時間下活性成分和抗氧化活性均在不斷變化,抗氧化活性的提高還可能與固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生的抗氧化肽有關(guān)[42]。國外有文獻(xiàn)報道[43],黑曲霉發(fā)酵木薯葉可提高蛋白質(zhì)的消化率并能降低粗纖維的含量。而且,黑曲霉能產(chǎn)生單寧酶[44]、植酸酶[45]等多種酶降解抗?fàn)I養(yǎng)因子。本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)接種黑曲霉的發(fā)酵組辣木莖葉粉單寧和植酸含量均有所下降,蛋白的體外消化率明顯提高。雖然辣木莖葉粉的粗蛋白絕對含量沒有變,但是在微生物發(fā)酵過程中累積了大量營養(yǎng)豐富的菌體蛋白和代謝產(chǎn)物,使得辣木莖葉粉營養(yǎng)價值得到改善。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)從蛋白營養(yǎng)品質(zhì)、抗?fàn)I養(yǎng)因子含量以及抗氧化活性等指標(biāo)多方面評價單一菌種和混菌組合發(fā)酵的方式對辣木莖葉粉效果的影響,發(fā)現(xiàn)混菌組合發(fā)酵優(yōu)于單一菌種。綜合考慮,黑曲霉、枯草芽孢桿菌和產(chǎn)朊假絲酵母三菌混合發(fā)酵的效果最佳,但仍需進(jìn)一步探討混菌發(fā)酵發(fā)酵辣木莖葉粉的最適環(huán)境條件。