氣質聯用法測定反復凍融畜禽肉中膽固醇及其氧化物含量

沈雅萍,王鳳玲,關文強,張 月

(天津市食品與生物技術重點實驗室,天津商業大學生物技術與食品科學學院,天津 300134)

肉類蛋白質含量高、質量好,是多種礦物質的較好來源[1]。雞肉、豬肉和牛肉是日常食用肉類,新鮮肉難以長時間貯藏,日常生活中經常會將肉凍藏,受環境影響可能會出現反復凍融現象,反復凍融會使肉中可溶性礦物質(如鉀和鈉)隨汁液而流失,水分減少,丙二醛含量增加[2],影響肉的品質,增加肉中的膽固醇氧化物的含量[3-5]。

膽固醇是一種對動物代謝具有重要作用的類固醇脂質,是膽汁酸、激素和維生素D的前體[6],廣泛存在于肉、蛋、水產品以及奶制品等動物源性食品中[7-8]。膽固醇含量較高的食物在加工或貯藏過程中,受氧氣、光照及各種促氧劑的作用,膽固醇的A環、B環或支鏈發生自氧化反應,生成多種氧化產物,稱為膽固醇氧化物(Cholesterol Oxidation Products,COPs)[9-10]。反復凍融的過程中,因為肉中含有化學性質非常不穩定且帶有多個雙鍵的多不飽和脂肪酸,在解凍過程中,多不飽和脂肪酸首先被氧化,產生游離基和過氧化物,而肉中膽固醇會在這些游離基和過氧化物的攻擊下發生氧化,生成膽固醇的過氧化物,這些過氧化物進一步分解,轉變為COPs[11]。COPs具有很強的細胞毒害性、突變性和致癌性,會引起動脈粥樣硬化,導致人體固醇類化合物代謝紊亂,危害人體健康[12-14]。Nam等[15]研究了貯存7 d后的新鮮生肉類在真空、空氣中、真空輻照、空氣中輻照條件下COPs含量的情況,發現COPs含量隨貯存時間增加而增加。

COPs的儀器測定方法有很多種,包括氣相色譜法[16-18]、高效液相色譜法[19-21]、氣相色譜-質譜聯用法[22-25]、核磁共振[26]和酶法[27]等。氣相色譜-質譜聯用具有高分辨率和高靈敏度的特點,常用于復雜組分的分離與鑒定,膽固醇組分復雜，宜用此法測定。Clariana等[28]研究用氣相色譜質譜法測定干腌肉中的COPs發現,25-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、20α-羥基膽固醇等多種氧化物的測定具有較好的可重復性,其精確度高達90%。本文采用氣相色譜-質譜串聯對反復凍融后雞肉、豬肉和牛肉中的膽固醇及其氧化物進行測定,考察反復凍融后各種肉中類膽固醇及其氧化物含量和相關指標變化情況，為保持冷凍肉品質提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

膽固醇標準品(99.7%) 國家計量科學研究院;5種COPs:7β-羥基膽固醇、5α,6α-環氧化膽固醇、20α-羥基膽固醇、7-酮基膽固醇、25-羥基膽固醇 SIGMA公司;1,1,3,3-四乙氧基丙烷(又名丙二醛乙縮醛) 上海信裕生物科技有限公司;硫代巴比妥酸(TBA) 西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司;正己烷(質譜純) 德國Merck公司;乙二胺四乙酸二鈉 天津市凱通化學試劑有限公司;雞胸肉(散養雞,雞大胸;月齡:7個月)、雞腿肉(散養雞,琵琶腿;月齡:7個月)、牛肉(黃牛,牛背長肌;月齡:30個月)、豬肉(白豬,豬后腿;月齡:10個月) 天津某超市,市售新鮮肉;實驗室用水 為超純水。

Trace1300氣相色譜儀、TSQ8000Evo三重四極桿質譜儀 美國Thermo公司;AS10200A 超聲波提取儀、ME215P電子天平 德國Sartorius公司;RE-52A 旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠;FJ200-SH數顯高速分散均質機 上海標本模型廠;DK-8D型電熱恒溫水槽 上海森信實驗儀器有限公司;Milli-Q水純化系統 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理 將雞肉、豬肉、牛肉實驗肉樣去皮、去骨、去筋,攪碎后放置-18 ℃冰箱冷凍。以冷凍24 h,室溫解凍6 h為1次凍融周期,分別對6個凍融周期的肉進行樣品測定,以未經冷凍為對照樣品。

1.2.2 GC-MS/MS測定膽固醇及其氧化物標品方法建立

1.2.2.1 標準溶液配制 分別準確稱取膽固醇及25-羥基膽固醇、7β-羥基膽固醇、20α-羥基膽固醇、5α,6α-環氧化膽固醇、7-酮基膽固醇標準品各2.50 mg(精確至0.01 mg),超聲混合均勻,配制濃度為100 μg/mL的膽固醇及其氧化物標準品的儲備液(標準品母液),置于25 mL棕色容量瓶,正己烷定容至刻度線,4 ℃下避光保存。

1.2.2.2 儀器測定參數 參考方益等[11]方法并有所修改。色譜條件:TG-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm);初始溫度80 ℃,保持0 min,以10 ℃/min的速率升溫至270 ℃,保持22 min;進樣口溫度250 ℃;進樣量1.0 μL不分流進樣;載氣為氦氣(He,純度>99.999%)。

質譜條件:傳輸線溫度250 ℃;EI離子源,離子源溫度200 ℃;電離能量:70 eV;采用特征離子實時掃描搜集模式SIM的掃描方式,掃描質量范圍50～650 m/z;溶劑延遲4 min。

1.2.2.3 GC-MS/MS方法學考察 標準曲線繪制:配制3、50、100、200、300 μg/mL不同濃度的膽固醇及0.2、1.0、3.0、5.0、10.0 μg/mL不同濃度的5種膽固醇氧化物的混合標準工作液,利用已建立的色譜條件和質譜條件下進行GC-MS/MS測定分析。

1.2.3 肉品中膽固醇及其氧化物含量的測定

1.2.3.1 脂肪提取 準確稱取1.2.1肉樣各2.0 g(精確至0.1 g)置于小錐形瓶中,向錐形瓶中加入配制好的Folch試劑(氯仿∶甲醇=2∶1,V/V)18 mL,振蕩封膜后放入4 ℃冰箱,靜置12 h,進行脂肪提取。取冰箱靜置后的脂肪提取液,放置到室溫后將提取液傾出至分液漏斗中,再用等量Folch試劑對殘渣進行提取。合并提取液于分液漏斗中,加入12 mL蒸餾水振蕩洗滌,靜置后分出下層溶液,經無水硫酸鈉脫水后于旋轉蒸發儀上45 ℃旋轉蒸干,得到脂類物質[29]。

1.2.3.2 皂化 向1.2.3.1脂類提取物的旋蒸瓶中加入1 mol/L KOH溶液10 mL,甲醇溶液10 mL,混合均勻后接冷凝管,于70 ℃水浴回流,皂化50 min,期間多次搖勻皂化液,皂化結束后冷卻至室溫。

1.2.3.3 膽固醇及其氧化物提取 在1.2.3.2皂化液中加入10 mL石油醚,振蕩搖勻進行提取,用分液漏斗分出下層石油醚溶液,無水硫酸鈉吸附水,得到粗提取的膽固醇及其氧化物的石油醚提取液。

在45 ℃下減壓旋轉蒸發,待完全蒸干,冷卻后即得膽固醇及其氧化物提取物,加入2 mL正己烷,200 W超聲5 min使其充分溶解,過0.22 μm的尼龍膜,放入進樣瓶后按照1.2.2方法對膽固醇及其氧化物含量進行檢測。

1.2.4 丙二醛測定 以丙二醛標準使用液的濃度為橫坐標,丙二醛含量為縱坐標,進行線性回歸分析,得到標準曲線為y=1.1457x+0.0455,R2=0.9999,線性范圍為0.01～0.80 μg/mL,根據標準曲線測定肉樣中的丙二醛含量。

準確稱取1.2.1肉樣10.0 g,加入40 mL 5%三氯乙酸混合液(三氯乙酸∶乙二胺四乙酸二鈉=75∶1,V/V)后于14000 r/min均質10 min,用中性濾紙過濾,再用5%三氯乙酸混合液將濾液定容至50 mL,取上述濾液5 mL置于25 mL具塞管內,加入5 mL TBA溶液(相當于0.02 mol/L),混勻,加塞,置于90 ℃水浴鍋內保溫40 min,取出冷卻10 min,在532 nm處測吸光值[30]。

1.2.5 水分測定 準確稱取1.2.1肉樣5.0 g,放入250 mL蒸餾瓶中,加入新蒸餾的甲苯75 mL,連接冷凝管與水分接收管,從冷凝管頂端注入甲苯,裝滿水分接收管。加熱慢慢蒸餾,水分全部蒸出后,從冷凝管頂端加入甲苯沖洗。待接收管水平面保持10 min不變時為蒸餾終點,讀取接收管水層的體積,即為肉樣的水分含量[31],同時以不加樣品的甲苯試劑做為空白對照。

1.3 數據處理

所有實驗都進行3次重復,所得數據均以均值±標準偏差表示,由TSQ8000Evo三重四極桿質譜儀中的TraceFinder軟件進行方法建立與數據分析。

2 結果與分析

2.1 標準品測定

2.1.1 GC-MS/MS色譜圖 根據優化后的色譜質譜條件,得出膽固醇及其5種氧化物的混標圖,如圖1所示。

圖1 膽固醇及其5種氧化物的混標色譜圖Fig.1 Mixed standard chromatogram of cholesterol and its five oxides注:A為膽固醇;B為5α,6α-環氧化膽固醇; C為20α-羥基膽固醇;D為25-羥基膽固醇; E為7β-羥基膽固醇;F為7-酮基膽固醇。

由圖1可以看出，膽固醇及其5種氧化物有較好的分離度。其中A為膽固醇,保留時間:21.41 min;B為5α,6α-環氧化膽固醇,保留時間:25.29 min;C為20α-羥基膽固醇,保留時間:26.34 min;D為25-羥基膽固醇,保留時間:27.07 min;E為7β-羥基膽固醇,保留時間:27.20 min;F為7-酮基膽固醇,保留時間:30.41 min。

2.1.2 GC-MS/MS質譜分析 通過RSM離子化,AutoSIM得出了定量離子和定性離子(見表1)。

由表1可看出，膽固醇及其氧化物每種物質有三對特征離子對(母離子/子離子對),通過定性離子對來確定其種類,利用定量離子來確定其含量。

表1 膽固醇及其5種氧化物的保留時間、母離子、子離子與碰撞能量Table 1 Retention time,parent ions,daughter ions and collision energies of cholesterol and its five oxides

2.2 方法學考察

2.2.1 標準曲線繪制 取1.2.2.3配制好的標準混合液,利用已建立的色譜條件和質譜條件下進行GC-MS/MS測定分析,以膽固醇及其5種氧化物的定量離子峰面積為縱坐標,標準工作溶液中被測組分的濃度為橫坐標作圖,得到線性方程和線性相關系數,如表2所示。

由表2可知,由于樣品中膽固醇含量較大,膽固醇標準曲線的線性范圍為3.0～300 μg/mL,膽固醇氧化物均為0.2～10.0 μg/mL,決定系數均在0.999以上,線性關系良好。

表2 膽固醇及5種COPs線性方程、相關系數、線性范圍及檢測限Table 2 Linear equation,correlation coefficient,linear range and detection limit of cholesterol and 5 kinds of cholesterol oxides

2.2.2 標準品穩定性考察 取適量新配制的10 μg/mL標準工作液,過0.22 μm濾膜,立即進行檢測,將得到的峰面積記為含量100%,即沒有損失;隨后分別測定放置0、2、4、6、8、10、12、24 h的標準品,對標準品進行穩定性考察。

從以上膽固醇及其5種氧化物標準溶液穩定性考察結果(圖2～圖3)可看出:膽固醇及其5種氧化物的標準品溶液在配制后6 h內基本穩定,4 h內使用效果最佳。

圖2 膽固醇標準溶液穩定性考察Fig.2 Stability study of cholesterol standard solution

圖3 5α,6α-環氧化膽固醇標準溶液穩定性考察Fig.3 Study on stability of 5α,6α-epoxy-based cholesterol standard solution

2.2.3 精密度考察 在儀器狀態穩定的情況下,按照優化后的GC-MS/MS條件進行檢測,用10 μg/mL膽固醇及其5種氧化物混合標準工作液平行測量五次,通過膽固醇及其5種氧化物的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)來考察儀器的精密度,測定結果表明，膽固醇及其5種氧化物的保留時間相對標準偏差(RSD)范圍為0.7%～2.8%,峰面積相對標準偏差范圍為0.8%～2.6%。

2.2.4 檢出限測定 用正己烷不斷稀釋膽固醇及其5種氧化物的標準工作液,以3倍于基線噪聲的響應信號所進樣品的濃度來計算檢出限。當信噪比(S/N)為3時,得到膽固醇及其5種氧化物的檢出限如表3所示。

由表3可知,膽固醇及其5種氧化物的檢出限均在0.02～0.08 μg/mL之間,能夠滿足反復凍融過程中對其變化的定量分析。

表3 膽固醇及其5種氧化物的檢出限Table 3 Detection limit of cholesterol and its five oxides

圖4 20α-羥基膽固醇標準溶液穩定性考察Fig.4 Study on stability of 20α-hydroxy-cholesterol standard solution

圖5 25-羥基膽固醇標準溶液穩定性考察Fig.5 Study on stability of 25-hydroxycholesterol standard solution

圖6 7β-羥基膽固醇標準溶液穩定性考察Fig.6 Study on stability of 7β-hydroxycholesterol standard solution

圖7 7-酮基膽固醇標準溶液穩定性Fig.7 Study on stability of 7-keto cholesterol standard solution

2.2.5 加標回收率測定 稱取已知含量的雞肉樣品(2.000±0.001) g,加入不同體積的10 μg/mL混合標準工作溶液,每個樣品取3次平均值測定,測定回收率,結果見表4。

表4 方法的回收率(n=3)Table 4 Recovery rate of the method(n=3)

由表4可知,在未經凍融的雞胸肉中加入3個不同濃度的標準物質混合樣,回收率范圍為79%～103%,RSD≤4.7%,實驗表明,所建立的方法能夠準確測定畜禽肉中膽固醇及其氧化物的含量。

2.3 肉品中膽固醇及其氧化物含量的測定

2.3.1 肉樣中膽固醇含量變化 由圖8可知，未凍融時,豬肉、牛肉、雞胸肉和雞腿肉中的膽固醇含量不同,隨著凍融次數的增加,膽固醇含量逐漸減少,其中牛肉中的膽固醇含量變化最大,減少量最高從380.72～348.25 μg/g,減少了32.47 μg/g,可能是由于肉中所含不飽和脂肪酸帶有多個雙鍵,性質不穩定,隨著凍融次數的增加,與環境中的氧發生氧化反應,氧吸收量急劇增加,由此產生的游離基和過氧化物進攻膽固醇的碳原子,使膽固醇自身產生游離基,引發鏈式反應,肉樣中膽固醇含量就會降低[15],劉莉敏等[32]曾在研究中表明,豬肉和牛肉中的膽固醇含量分別為(52.72±6.19)和(49.98±12.31) mg/100 g,陳艷美等[33]曾對不同月齡檳榔江公水牛肉中膽固醇進行研究,其中成年期水牛膽固醇含量最低,為(22.65±3.70) mg/100 g(背最長肌),其研究結果均與本測定結果保持一致。

圖8 反復凍融過程中肉樣膽固醇含量的變化Fig.8 Changes in meat-like cholesterol content during repeated freezing and thawing

2.3.2 畜禽肉樣中膽固醇氧化物含量的變化 由圖9可知,雞腿肉中的COPs含量變化隨著凍融次數的增加而增加,凍融1次后5種COPs均大幅度增加,凍融3次后5種COPs均趨于平穩,其中5α,6α-環氧化膽固醇從未檢出上升到0.48 μg/g、20α-羥基膽固醇從未檢出上升到0.401 μg/g、25-羥基膽固醇從未檢出上升到0.500 μg/g、7β-羥基膽固醇從未檢出上升到0.601 μg/g、7-酮基膽固醇從未檢出上升到0.170 μg/g。

圖9 雞腿肉中膽固醇氧化物含量變化Fig.9 Change in cholesterol oxide content in chicken thigh

由圖10可知,雞胸肉中的COPs含量變化隨著凍融次數的增加而增加,在第3次凍融前除5α,6α-環氧化膽固醇外,其他COPs均有不同程度的增加,第3次凍融后逐漸趨于平穩。5α,6α-環氧化膽固醇凍融5次以內均從未檢出,直到凍融到第7次(肉樣將壞)時檢出量為0.277 μg/g。7β-羥基膽固醇變化量最大,從未檢出上升到0.600 μg/g。

圖10 雞胸肉中膽固醇氧化物含量變化Fig.10 Change of cholesterol oxide content in chicken breast

由圖11可知,牛肉中的COPs含量變化隨著凍融次數的增加而增加,5種COPs在1個凍融周期后均大幅度增加,直至第4次凍融完成才趨于平穩,其中7β-羥基膽固醇增加量最多,從未檢出上升到0.615 μg/g,比20α-羥基膽固醇的增加量高出了0.307 μg/g,且5α,6α-環氧化膽固醇的含量也高于雞胸肉和雞腿肉。

圖11 牛肉中膽固醇氧化物含量變化Fig.11 Changes in the content of cholesterol in beef

由圖12可知,豬肉中的COPs含量變化隨著凍融次數的增加而增加,第1次凍融后5種COPs大幅度增加,第5次凍融后趨于平穩,但各氧化物間的差異不是很明顯,豬肉中5種COPs的含量均高于牛肉、雞腿肉及雞胸肉,分析是由于其膽固醇含量較高導致,其中7β-羥基膽固醇從未檢出上升到0.657 μg/g。

圖12 豬肉中膽固醇氧化物含量變化Fig.12 Changes in the content of cholesterol in pork

綜合圖9～圖12來看,肉凍融1次后,膽固醇含量相對較高,豬肉膽固醇含量最高為387.1 μg/g,COPs含量相對較低,其中含量最高的是豬肉中的5α,6α-環氧化膽固醇,含量為0.532 μg/g;凍融5次以上后,膽固醇含量大幅度降低,COPs含量上升。豬肉和牛肉因為膽固醇含量高于雞肉,且與雞肉相比含有較高的脂肪和血紅素,更容易氧化,所以COPs含量要高于雞肉。

2.4 反復凍融對肉品質的影響

肌肉在冷凍后,發生冷收縮,在解凍時會發生解凍僵直,肉的保水性變差,水分流失,同時由于肌纖維失去完整性[34],加速了脂肪氧化,丙二醛含量增加。

2.4.1 肉水分含量變化 由圖13可知，隨著肉樣的反復凍融,肉樣中的水分含量逐漸下降,其中豬肉中的水分減少量為14.236 g/100 g,牛肉中的水分減少量為11.188 g/100 g,雞腿肉中的水分減少量為5.816 g/100 g,雞胸肉中的水分減少量為14.472 g/100 g。肉中含量最多的成分是水,凍結過程中水分凝結形成冰晶,肌肉細胞受到機械性破壞,解凍時出現汁液流失，并導致肉中水分減少[35]。

圖13 反復凍融過程中肉樣水分含量變化圖Fig.13 Changes of meat moisture content during repeated freezing and thawing

2.4.2 肉中丙二醛含量變化 由圖14可知，凍融1次時雞肉樣中均未檢出丙二醛,隨著凍融次數增加,肉樣中丙二醛含量增加,其中牛肉中丙二醛從未檢出上升到1.004 μg/g,含量增加最多,可能是由于反復凍融過程中，自由基作用于脂質，發生過氧化反應,氧化終產物為丙二醛,從而引起蛋白質、核酸等生命大分子的交聯聚合,使之具有細胞毒性[36]。結果表明,新鮮肉樣中不含丙二醛,隨著凍融次數的增加，丙二醛含量也逐漸增加,與膽固醇氧化物形成趨勢相同。

圖14 反復凍融過程中肉樣丙二醛含量變化Fig.14 Change of malondialdehyde content in meat samples during repeated freezing and thawing

3 結論

本實驗采用氣相色譜-質譜聯用測定了反復凍融后雞肉、牛肉、豬肉中膽固醇及其氧化物的含量變化。結果表明:新鮮肉中不存在COPs,反復凍融造成膽固醇的含量逐漸減少,COPs含量增加,其中牛肉中的膽固醇含量減少尤為明顯,減少量為32.47 μg/g。雞腿肉中7β-羥基膽固醇含量增加最為明顯,增加量為0.601 μg/g,減少的膽固醇轉化成COPs以及其他物質,過程比較復雜,5種COPs的含量隨著凍融次數的增加而增加,最終趨于平衡。

對反復凍融過程中畜禽肉中水分進行測定,發現水分含量隨著凍融次數增加而減少,新鮮肉中不含丙二醛,反復凍融后,肉中產生丙二醛,其含量隨凍融次數增加而增加,這與膽固醇氧化物形成趨勢一致,反映出畜禽肉凍融過程中自由基作用于脂質發生了氧化反應。建議生產和生活過程中要盡量避免肉的反復凍融。