發酵牛肉調味基料替代亞硝酸鹽在紅腸中的應用

樊曉盼,劉靜靜,李春萌,梁麗雅,吳晨燕,馬儷珍2,,*

(1.天津農學院工程技術學院,天津 300384; 2.天津市農副產品深加工技術工程中心,天津 300384；3.天津農學院食品科學與生物工程學院,天津 300384)

熱反應調味基料是利用氨基酸、多肽等蛋白質水解物與還原糖、脂類等在一定條件下加熱發生美拉德反應生成的風味物質(Maillard reaction products,MRPs)。從20世紀中葉起,香料界就開始采用美拉德反應技術合成增香調味品。20世紀50年代,英國Morton采用美拉德反應技術成功制備出肉味香精并申請專利,開創了肉類香料的快速發展并實現了商業化生產[1];Beak等[2]選用不同的商業酶水解小龍蝦加工過程中的廢棄下腳料,制得富有自然香氣的調味產品。劉丹等[3]通過優化美拉德反應工藝條件制備出肉香味渾厚的兔肉香精，并將其微膠囊化,拓寬了國內肉類香精的市場。劉金凱等[4]以氨基酸和還原糖為原料經美拉德反應制得肉味濃烈、香氣柔和的羊肉味調味基料。呂玉[5]模擬反應體系制備出有明顯牛肉特征味的牛肉香精。目前關于肉味調味基料的研究主要集中于酶解過程和美拉德熱反應階段工藝參數的優化[6-7]。

食品工業領域廣泛使用的抗氧化劑BHA、BHT、TBHQ等由于可能具有致癌性,一些歐美國家已禁止使用[8]。而經美拉德反應制成的調味基料所包含的類黑精、還原酮類及一系列含硫、含氮揮發性雜環化合物具有一定的抗氧化性,能夠被用來替代酚類食用抗氧化劑[9]。本實驗室前期在傳統調味基料的制備工藝基礎上增加了微生物發酵環節制成發酵牛肉調味基料(Fermented beef flavor,FBF),FBF由于經過微生物發酵，被賦予了特殊的發酵香氣,經檢測,FBF具有較強的抑菌性(對大腸桿菌的抑菌圈達到22 mm)和抗氧化性(總抗氧化能力為6.17 U/mL,抗超氧陰離子為2212.17 U/L,抑制羥自由基能力為3069.80 U/mL,自由基清除率為94.73%)。此外,有文獻報道[10],微生物發酵法可替代肉制品中的亞硝酸鹽的呈色作用。某些乳酸菌和其他微生物可在不添加亞硝酸鹽的條件下,在模擬肉體系中將高鐵肌紅蛋白(Met-Mb)轉化,生成具有紅色的肌紅蛋白衍生物—氧合肌紅蛋白(MbO2)或亞硝基肌紅蛋白(NO-Mb)等,替代亞硝酸鹽起呈色作用。

由此課題組提出假設,FBF在滿足提高肉制品風味的前提下,也許可以替代亞硝酸鹽的發色、抑菌和提高風味的作用,從而可以替代或者部分替代亞硝酸鹽，從而大大提高產品的安全性。本試驗將不同比例的FBF應用于紅腸的加工中,對成品進行感官評定，并測定其在貯藏過程中的品質及微生物多樣性變化情況,進而考察其替代亞硝酸鹽的作用效果。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牛骨肉末 冷凍牛胴體電鋸分割時留下的肉末(骨肉比為3∶7),天津掛月食品有限公司;薩科THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌) 上海昊岳實業有限公司;風味蛋白酶(500 LAPU/g)、蛋白酶(1.5 AU/g) 丹麥諾維信公司;新鮮牛前肩肉、豬通肌、豬背膘 天津市康寧肉制品有限公司;白砂糖、葡萄糖、食鹽、淀粉、料酒、大蒜、雞蛋、白胡椒粉、NaNO2、抗壞血酸鈉、復合磷酸鹽等 均為食品級，天津紅旗農貿市場;2-硫代巴比妥酸、三氯乙酸、EDTA、三氯甲烷、鹽酸、硼酸、氧化鎂、甲基紅、溴甲酚綠、95%乙醇等 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

SX-500高壓蒸汽滅菌鍋 日本TOMY有限公司;THZ-98AB型恒溫振蕩器 上海一恒科學儀器有限公司;Friocell 22恒溫恒濕培養箱 艾力特國際貿易有限公司;XZ-5L灌腸機 廣州旭眾食品機械有限公司;BS 224S電子天平 賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;UV-180紫外分光光度計 日本島津公司;CM-5色差儀 日本KONICA MINOLTA公司;ST40R冷凍離心機 德國Theromo Scientific;BJ-MM12絞肉機 廣東省韶關北江機電廠;FA2高速剪切乳化分散機 上海弗魯克流體機械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 FBF的制備 以牛骨肉末為原料,經熱-壓浸提、酶解、發酵后，添加葡萄糖、木糖和氨基酸制成FBF[11]。

1.2.2 紅腸制作 設計5組紅腸,5組紅腸的原輔料配方完全一致(見表1),具體分組為:既不添加亞硝酸鹽又不添加FBF的陰性對照組(Negative control,NC)、添加亞硝酸鹽的陽性對照組(Positive control,PC),分別添加2%、6%和10%FBF的樣品組。紅腸加工時,按照表1的配方,在牛肉、豬瘦肉中分別加入腌制劑,攪拌均勻,腌制12 h(4 ℃),然后加入其他輔料真空攪拌后灌腸,再經烤制、蒸煮和煙熏等工序制成紅腸,冷卻后真空包裝,對成品進行感官評價,然后貯藏于20 ℃條件下,分別在第0、5、10、15、20、25和30 d測定其紅度a*值、脂肪氧化值(TBARs),并根據理化指標變化情況,選擇部分樣品進行微生物多樣性分析。

表1 試驗設計Table 1 Design of the test

1.3 指標測定方法

1.3.1 感官評價 感官評定小組由10 名經過培訓的食品專業人員組成(男女各半,年齡23～45歲)。感官評定之前,所有評定人員需在感官評定室待1 h以適應環境。此外,為了減少樣品間的影響,評價每個樣品前需要用清水漱口。具體評分標準見表2。

1.3.2 紅度a*值的測定 將絞碎后的均勻樣品平鋪于比色皿內,確保測定表面平整,以標準白板為標準對樣品紅度a*值進行測定。

1.3.3 TBARs值的測定 取5.0 g切碎的樣品,加15 mL 7.5%的TCA溶液,勻漿,過濾,取濾液2.5 mL,加入等體積的0.02 mol/L 2-硫代巴比妥酸,沸水浴40 min,迅速冷卻,加入3 mL氯仿,混勻,2 ℃、2000×g條件下離心10 min,取上清液,532 nm波長處測吸光度,按照以下公式計算:

式中:A-吸光度;V-樣品體積;M-丙二醛的分子量72.063;ε-摩爾吸光系數156;l-光程1(cm),光學路徑長度;m-樣品質量(g)。

1.3.4 微生物多樣性分析 由于2% FBF添加量的紅腸抗氧化效果較好,所以分別選擇PC組、NC組、2% FBF組(記為F),在貯藏期第0、15、30 d,參考朱迎春等[12]的方法對樣品進行微生物多樣性分析。

1.4 數據統計分析

用Microsoft Excel 2003計算各指標的平均值和標準差,用Statistix 8.1中Turkey test程序對數據差異顯著性(p<0.05)進行分析,用Sigmaplot 10.0進行繪圖。試驗重復進行3次。

2 結果與分析

2.1 不同處理組紅腸成品的感官評定結果

表3為5組紅腸成品的感官評價結果。與NC組(產品呈現暗褐色)相比,其余4組(PC組和2% FBF、6% FBF、10% FBF)的各項感官評價指標均明顯較高。PC組由于添加了亞硝酸鹽,而亞硝酸鹽具有促進發色、抑菌、抗氧化和提高風味的作用,所以PC組的紅腸色澤誘人,且具有良好的風味,但聞起來香氣不濃郁;添加2%和6% FBF后,紅腸香氣有明顯改善,濃郁而飽滿,但添加量為10%時,則會表現出香氣刺鼻的不良現象,且產品肉質松散,口感粗糙。這是因為FBF添加量越大,紅腸中脂肪含量越高,添加10%的FBFH組脂肪含量高于其他組,脂肪對產品的滋味具有重要貢獻作用,但并非越高越好,尤其是人體對其的感官評價，脂肪含量過高,反而消費者不易接受。試驗發現,凡是添加FBF的紅腸,均表現出淡紅色,與PC組相當,明顯好于NC組。

表3 紅腸感官評價結果Table 3 Result of sensory evaluation of sausage

2.2 不同處理組紅腸在貯藏期間紅度值的變化

5組紅腸貯藏過程中的紅度值如圖1所示。從圖1中可看出,NC組的紅度值顯著低于PC組和3個試驗組(p<0.05),而后四組之間則無顯著差異,紅度值處于8.49～10.99之間。亞硝酸鹽是肉制品加工過程中常用的發色劑,在一定的酸性條件下,亞硝酸鹽能夠生成亞硝酸,亞硝酸不穩定,繼續分解產生NO,NO與肌紅蛋白反應生成鮮艷的、亮紅色的亞硝基肌紅蛋白,因此PC組紅度值較高。試驗組是添加了FBF,有研究表明,乳酸菌具有產NO的能力,可將高鐵肌紅蛋白轉化為亞硝基肌紅蛋白。Moller等[13]在含有高鐵肌紅蛋白的MRS瓊脂培養基中接種商業用發酵劑中的戊糖片球菌,結果發現,高鐵肌紅蛋白可被轉化為氧合肌紅蛋白,使肉呈鮮紅色。葡萄球菌由于其能夠產生蛋白酶和脂酶,分解蛋白質和脂類物質形成特殊的風味而廣泛應用于傳統肉制品中。Morita等[14]研究發現，從肉塊中分離的肉葡萄菌(Staphylococcuscarnosus)和溶酪葡萄球菌(Staphylococcuscaseolyticus)在培養基和肉基質中均可將棕色的高鐵肌紅蛋白轉化為紅色的肌紅蛋白衍生物。本試驗所添加的FBF是添加薩科THM-17(木糖葡萄球菌+戊糖片球菌)發酵制成,具有轉化高鐵肌紅蛋白的能力,因此能夠提高紅腸的紅度值。

圖1 5組紅腸貯藏過程中紅度值的變化Fig.1 Changes of a* value of five sausage during the storage process

2.3 5組紅腸在貯藏期間TBARs值的變化

5組紅腸貯藏過程中的TBARs值如圖2所示。從圖2中可看出,5組紅腸的脂肪氧化程度整體呈上升趨勢,PC組的TBARs值始終較低,這是因為亞硝酸鹽具有較強的抗氧化性。添加2%和6% FBF制成的紅腸TBARs值在0～5 d與NC組差異不顯著(p>0.05),貯藏中后期始終低于NC組,雖然整體高于PC組(p<0.05),且在貯藏過程中TBARs值始終低于1.0 mg/kg,這說明FBF具有一定的抗氧化性,具有應用于紅腸中替代亞硝酸鹽抗氧化性的潛力。而添加6% FBF制成的紅腸TBARs值反而高于2% FBF組,10%FBF制成的紅腸TBARs值甚至高于NC組,出現這一現象的原因可能是FBF中本身含有一定量的脂肪,在貯藏過程中,其自身的脂肪也會發生氧化變質,因此TBARs值較高,進而導致紅腸味評分低于其他組(見表3)。

圖2 5組紅腸貯藏過程中TBARs值的變化Fig.2 Changes of TBARs of fivesausage during the storage process

2.4 3組紅腸在貯藏期間的菌相變化

2.4.1 紅腸貯藏過程中微生物的多樣性分析 表4為經過最低序列數抽平分析的Alpha多樣性指數表。通過單樣品的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐富度和多樣性。Chao1和Observed species指菌種豐富度指數,指數越大,表明微生物群落豐富度越高。Shannon指數用來估算樣品中微生物多樣性,Shannon值越大,說明群落多樣性越高[15]。

表4 樣品Alpha多樣性指數表Table 4 Alpha diversity metrics of different samples

由表4可知,3組新鮮紅腸(NC0、PC0和F0)的Chaos1指數、Observed species和Shannon指數均較高,說明新鮮紅腸具有豐富的細菌群落,群落多樣性較高。隨著貯藏時間的延長,添加FBF的試驗F組的細菌豐富度和多樣性呈逐漸下降趨勢,并且較NC組下降趨勢更為明顯,這說明本試驗添加的FBF具有一定的抑菌性,能夠抑制某些微生物的生長。而PC組在貯藏到15 d時微生物群落豐富度和多樣性均有所下降,這是因為亞硝酸鹽抑菌性較強,能夠抑制肉毒梭狀芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、產氣莢膜桿菌(Clostridiumperingens)等致病菌[15]的生長。而貯藏到30 d時,群落豐富度和多樣性又有所提高,是由于在這個過程中,產品已經腐敗變質,蛋白質和脂肪發生降解而產生一些低分子堿性化合物,使得產品pH提高,為某些能夠分解蛋白和脂肪的微生物如金黃色葡萄球菌提供條件[16],某些之前受到抑制的微生物又有所增長,從而導致樣品的微生物群落豐富度和多樣性隨之提高。

2.4.2 紅腸貯藏過程中基于門水平的微生物群落結構分析 3組紅腸在貯藏過程中基于門水平的微生物群落結構如圖3所示,從圖3中可看出,所有紅腸樣品的微生物群落主要由3個門構成,分別為:Firmicutes(厚壁菌門)、Proteobacteria(變形菌門)和Cyanobacteria(藍藻門)。對于新鮮樣品即貯藏0 d來說,NC組中厚壁菌門所占比例最高,占到66.48%,且隨著貯藏到15 d時,其相對含量達到92.06%,此時產品已經腐敗;而PC組和試驗F組在0 d時群落結構組成相似,厚壁菌門所占比例較低,分別為4.39%和8.46%,隨著貯藏時間的延長,其豐度呈顯著上升趨勢,PC組從4.39%上升到89.86%,F組從8.46%上升到90.43%。相同貯藏時間點,F組的厚壁菌門含量始終高于PC組,而明顯低于NC組(除30 d外),貯藏到30 d時兩組樣品均已腐敗,此時厚壁菌門所占比例最高,且與NC組樣品腐敗時(NC15)的微生物群落結構相似,說明厚壁菌門是導致紅腸變質的優勢腐敗菌,試驗F組添加的FBF對其有一定的抑制作用,從而延長產品的保質期,達到跟添加亞硝酸鹽組相當的效果。

圖3 基于門水平的微生物群落結構變化Fig.3 Changes of microbial community structure based on the phylum level

2.4.3 紅腸貯藏過程中基于屬水平的微生物群落結構分析 表5是3組紅腸貯藏期間基于屬水平的微生物群落結構分布情況,用來直觀反映樣品在貯藏過程中的群落結構動態變化。經鑒定,本試驗9個樣品均有6個屬的細菌豐度較高。新鮮NC組紅腸樣品(NC0)中芽孢桿菌屬(Bacillus)豐度達到63.97%,占主導地位,其次是葡萄球菌屬(Staphylococcus),豐度為1.47%,其他菌屬豐度不高,但種類豐富。貯藏到15 d時(NC15),Bacillus豐度降至18.65%,Staphylococcus豐度增長到70.89%,結合理化檢測結果(圖2)和感官評價(樣品表面發黏,有明顯酸敗味),說明貯藏到15 d時,NC組樣品已腐敗變質,Staphylococcus是導致產品變質的優勢腐敗菌屬。當樣品繼續貯藏至30 d時(NC30),Staphylococcus的豐度降低(27.53%),乳球菌屬(Lactococcus)和魏斯氏菌屬(Weissella)的豐度分別達到20.48%和25.12%,說明當樣品腐敗之后,蛋白、脂肪等一些物質降解形成的體系,為其他菌屬的成長提供了豐富的營養源。

表5 基于屬水平的微生物群落結構(%)Table 5 Microbial community structure based on the genus level(%)

新鮮PC組紅腸樣品(PC0)中各菌屬相對豐度差異不明顯,最高為Staphylococcus(1.54%),貯藏到15 d時,樣品(PC15)中克雷伯菌屬(Klebsiella)和Staphylococcus占優勢地位,豐度分別達到62.37%和15.84%,當貯藏到30 d時樣品(PC30)已明顯腐敗,腐敗狀態時厭氧芽孢桿菌屬(Clostridiumsensustricto)和Staphylococcus的豐度較高,分別為38.51%和35.01%,說明Clostridiumsensustricto和Staphylococcus是紅腸貯藏后期的優勢腐敗菌屬。

F組紅腸樣品在貯藏前期的微生物群落結構與PC組樣品基本相似。新鮮樣品(F0)各菌屬豐度均不高,隨著貯藏到15 d(F15)時,Staphylococcus豐度急劇上升為48.63%,其次是Bacillus,占到17.30%,Klebsiella占到10.69%,而到貯藏終點時(F30),Staphylococcus豐度為41.13%,Weissella的豐度為34.66%,二者總豐度達到75.79%,成為導致紅腸腐敗的優勢腐敗菌屬,這一結果為我們后期進一步研究調味基料的抑菌性提供了思路,可以從這幾種優勢腐敗菌為切入點,尋找對其有抑制作用的菌株，應用于FBF的制備。

3 小結

在紅腸中添加一定比例的FBF能夠提高產品香氣,使產品肉香飽滿,風味獨特。添加FBF制成的紅腸在貯藏期間紅度值顯著高于NC組(p<0.05),而與PC組色澤差異不顯著;添加2%和6%FBF制成的紅腸貯藏中后期的TBARs值顯著低于NC組的TBARs值(p<0.05);從微生物多樣性結果來看,添加FBF的紅腸與PC組紅腸微生物群落結構相似,到腐敗狀態時葡萄球菌均成為其優勢腐敗菌屬,說明本試驗添加的FBF對其有一定的抑制作用,能夠延長產品貨架期,有望成為肉制品加工過程中的一類天然腌制劑。