miR-143在卵泡刺激素介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞孕酮生成中的作用

高小博，姚楠，2，鄭盼盼，2，駱海燕，馬旭，陸彩玲，2*

(1.國(guó)家衛(wèi)生健康委科學(xué)技術(shù)研究所遺傳優(yōu)生中心，北京 100081；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院，北京 100005)

顆粒細(xì)胞是卵泡的重要組成部分，圍繞在卵母細(xì)胞周?chē)鸀槠涮峁I(yíng)養(yǎng)并參與卵泡的發(fā)育。顆粒細(xì)胞也是女性性激素(主要包括甾體激素雌激素和孕酮)的主要來(lái)源，這些性激素調(diào)控了正常的月經(jīng)周期和生殖，因此顆粒細(xì)胞的增殖和分化是女性擁有正常生育功能的必要因素[1]。在卵泡刺激素(FSH)的刺激下，顆粒細(xì)胞增殖、分化以及具有了合成甾體激素的能力[2]。

miRNAs是一類(lèi)長(zhǎng)約22nt的非編碼的單鏈RNA分子，廣泛存在于線蟲(chóng)、植物、動(dòng)物及人類(lèi)的細(xì)胞中。miRNA作為基因轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控因子，主要以堿基配對(duì)的方式結(jié)合到靶mRNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)，通過(guò)抑制或促進(jìn)翻譯或降解mRNA的方式進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3-4]。miR-143是一個(gè)高度保守的miRNA，在血管損傷和重構(gòu)[5]、血液腫瘤發(fā)生和發(fā)展[6]、脂肪分泌及能量代謝[7]和調(diào)控神經(jīng)功能[8]等方面扮演重要角色。近年來(lái)，隨著對(duì)miRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)miRNA在顆粒細(xì)胞增殖和甾體激素分泌中具有廣泛的調(diào)節(jié)作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-143主要分布于小鼠卵巢的卵泡顆粒細(xì)胞中，隨著卵泡的發(fā)育miR-143在初級(jí)和次級(jí)卵泡中的表達(dá)水平較高[9]。Zhang等[10]證明在FSH介導(dǎo)的小鼠顆粒細(xì)胞中，miR-143沉默顯著促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，并且miR-143抑制劑在翻譯和翻譯后水平上調(diào)3β-羥基固醇脫氫酶(3β-HSD)、芳香化酶(CYP19A1)、17β-羥類(lèi)固醇脫氫酶(17β-HSD1)等甾體激素合成相關(guān)基因的表達(dá)。然而，miR-143對(duì)FSH顆粒細(xì)胞孕酮生成的影響未見(jiàn)報(bào)道，本文進(jìn)行了miR-143對(duì)FSH誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞產(chǎn)生孕酮的作用研究。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，RNA提取試劑Trizol(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，DMEM/F12液體培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)，對(duì)照重組腺病毒Ad-miRNC和過(guò)表達(dá)miR-143的重組腺病毒Ad-miR143均購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司，miR-143 TaqMan MicroRNA Assays(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，碘[125I]孕酮放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所有限公司)。CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，ABI Prism 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，TC-512梯度PCR儀(英國(guó)Techne公司)，xh6080放免儀(西安核儀廠)。

二、研究方法

1.原代顆粒細(xì)胞培養(yǎng)：21日齡的雌性SD大鼠購(gòu)自于維通利華公司，本研究所有實(shí)驗(yàn)均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理與使用指南》的要求進(jìn)行。每只SD大鼠腹腔注射20 U的孕馬血清(PMSG)飼養(yǎng)48 h后，頸椎脫臼處死并在無(wú)菌條件下取出雙側(cè)卵巢，剔除卵巢被膜及周?chē)M織，用1 ml注射器針頭刺破卵泡使顆粒細(xì)胞釋放出來(lái)，將顆粒細(xì)胞重懸于含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中，并以合適的密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以備后續(xù)處理。

2.顆粒細(xì)胞RNA提取：取35 mm培養(yǎng)皿中經(jīng)過(guò)不同處理的原代顆粒細(xì)胞，棄培養(yǎng)液后加入PBS洗2次，吸去PBS后加入RNA提取試劑Trizol，充分吹打至細(xì)胞完全裂解后，利用苯酚/氯仿抽提、異丙醇沉淀的方法提取RNA。

3.顆粒細(xì)胞miRNA實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)：miR-143實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè)根據(jù)Applied Biosystems公司的TaqMan MicroRNA Assays試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，首先采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后再采用miR-143特異性的TaqMan探針進(jìn)行檢測(cè)。

4.病毒感染及FSH處理：原代顆粒細(xì)胞在含有15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，12 h后，DMEM/F12清洗細(xì)胞2～3次，洗去未貼壁的細(xì)胞，每個(gè)35 mm培養(yǎng)皿中加入1.5 ml含有10%FBS、無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基，以3×1011粒子/ml的腺病毒感染顆粒細(xì)胞，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5 h，隨后將培養(yǎng)基換為無(wú)血清、無(wú)抗生素的DMEM/F12培養(yǎng)基，于CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，加入含有50 ng/ml FSH的無(wú)酚紅DMEM/F12培養(yǎng)基處理感染后的顆粒細(xì)胞。

5.放射免疫法測(cè)定孕酮：24孔板每孔中加入約5×105個(gè)顆粒細(xì)胞，用500 μl含15%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基于37℃、CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，然后進(jìn)行相應(yīng)處理。培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞上清200 μl，儲(chǔ)存于-20℃，按照孕酮放射免疫分析試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定孕酮的水平。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、FSH誘導(dǎo)原代顆粒細(xì)胞分泌孕酮模型的建立

分離大鼠原代顆粒細(xì)胞后用生理鹽水和50 ng/ml的FSH分別處理24 h，通過(guò)放射免疫測(cè)定技術(shù)(RIA)分析FSH刺激顆粒細(xì)胞后的孕酮水平，結(jié)果顯示FSH處理細(xì)胞后孕酮水平顯著增加(P<0.001)(圖1)。

注：與生理鹽水處理組比較，***P<0.001圖1 FSH誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞分泌孕酮結(jié)果

二、FSH對(duì)原代顆粒細(xì)胞miR-143表達(dá)的影響

用50 ng/ml的FSH分別處理原代顆粒細(xì)胞0、6、12、24和48 h后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)miR-143的表達(dá)量，以U6 snRNA的表達(dá)水平為內(nèi)參，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-143在FSH處理顆粒細(xì)胞6、12 h后表達(dá)沒(méi)有顯著變化，在24 h后表達(dá)顯著增加(P<0.01)，在48 h時(shí)表達(dá)量最高(P<0.001)(圖2)。

注：與未經(jīng)FSH處理組比較，**P<0.01，***P<0.001圖2 FSH對(duì)原代顆粒細(xì)胞miR-143表達(dá)的影響

三、重組腺病毒過(guò)表達(dá)miR-143的鑒定

用對(duì)照重組腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分別感染原代顆粒細(xì)胞后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)miR-143過(guò)表達(dá)水平，以U6 snRNA為內(nèi)參。結(jié)果顯示，與對(duì)照Ad-miRNC組相比，感染Ad-miR143組的細(xì)胞miR-143表達(dá)水平顯著增加(P<0.01)(圖3)。

注：與對(duì)照重組腺病毒Ad-miRNC組比較，**P<0.01圖3 重組腺病毒Ad-miR143感染細(xì)胞后的miR-143表達(dá)結(jié)果

四、過(guò)表達(dá)miR-143對(duì)顆粒細(xì)胞孕酮分泌水平的影響

用對(duì)照重組腺病毒Ad-miRNC和Ad-miR143分別感染原代顆粒細(xì)胞后，加入50 ng/ml FSH再處理細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞上清檢測(cè)孕酮水平。結(jié)果表明，未經(jīng)FSH處理的各組之間孕酮分泌水平?jīng)]有顯著差異。經(jīng)FSH處理與未經(jīng)FSH處理比較，各組孕酮分泌水平顯著升高(P<0.001)，且感染Ad-miR143組與空白對(duì)照組和對(duì)照腺病毒組相比，孕酮分泌水平顯著升高(P<0.01)(圖4)。

注：與未經(jīng)FSH處理組比較，***P<0.001；與對(duì)照重組腺病毒Ad-miRNC組比較，##P<0.01圖4 miR-143過(guò)表達(dá)增加FSH刺激的顆粒細(xì)胞孕酮分泌

討 論

FSH受體(FSHR)是視紫紅素樣G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員，特異性表達(dá)于卵巢顆粒細(xì)胞和睪丸支持細(xì)胞。FSHR以細(xì)胞內(nèi)側(cè)的C末端結(jié)束，該末端包含受體的重要功能模體[11]。FSH促進(jìn)卵泡的募集，支持腔卵泡的生長(zhǎng)、成熟和選擇，通過(guò)與顆粒細(xì)胞上FSHR結(jié)合激活一系列信號(hào)級(jí)聯(lián)引發(fā)優(yōu)勢(shì)卵泡排卵的生物學(xué)功能[12]。FSH與顆粒細(xì)胞上的FSHR結(jié)合，激活腺苷酸環(huán)化酶，提高細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)水平，并激活蛋白激酶A(PKA)，然后PKA可以直接磷酸化調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄相關(guān)蛋白質(zhì)包括Y盒結(jié)合蛋白1(YB-1)、組蛋白H3、cAMP響應(yīng)原件結(jié)合蛋白(CREB)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等，也可以間接激活以轉(zhuǎn)錄和翻譯為主要調(diào)控目標(biāo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)，進(jìn)而促進(jìn)顆粒細(xì)胞增殖和甾體激素的合成[13]。

哺乳動(dòng)物卵泡形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，F(xiàn)SH是卵泡在竇期以后正常發(fā)育的關(guān)鍵，是卵泡存活的主要因素，通過(guò)激活多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)卵泡成熟所需的基因[14]。卵泡發(fā)育過(guò)程伴隨顆粒細(xì)胞增殖和分化以及甾體激素的分泌。我們課題組前期用FSH處理KK-1顆粒細(xì)胞系，利用Northern blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)10 ng/ml FSH抑制了miR-143、let-7a、miR-125b的表達(dá)，提示FSH在顆粒細(xì)胞中的作用受miRNA的調(diào)控[9]。在本研究中，我們利用50 ng/ml FSH處理原代顆粒細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)FSH處理24、48 h后上調(diào)miR-143的表達(dá)，這種差異可能與細(xì)胞類(lèi)型和FSH處理劑量不同有關(guān)。張建芳等[15]利用原位雜交和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠卵巢，發(fā)現(xiàn)miR-143在顆粒細(xì)胞中的表達(dá)量約為卵母細(xì)胞中表達(dá)量的20倍，主要定位于各級(jí)卵泡的顆粒細(xì)胞。隨后他們證明從性交后15.5 d到產(chǎn)后4 d原始卵泡形成過(guò)程中，miR-143表達(dá)增加，原位雜交結(jié)果顯示miR-143定位于前顆粒細(xì)胞，并通過(guò)抑制前顆粒細(xì)胞增殖和下調(diào)細(xì)胞周期相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)抑制原始卵泡的形成，表明miR-143對(duì)原始卵泡的形成至關(guān)重要[16]。這些研究提示miR-143通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的增殖和功能參與卵泡的發(fā)育。Du等[17]發(fā)現(xiàn)FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通過(guò)靶向下調(diào)FSHR的表達(dá)，降低細(xì)胞內(nèi)PKA和AKT等信號(hào)分子水平，誘導(dǎo)豬顆粒細(xì)胞凋亡和卵泡閉鎖，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TGFβ信號(hào)分子SMAD4通過(guò)直接與miR-143的啟動(dòng)子結(jié)合抑制miR-143的表達(dá)，從而正向調(diào)控FSHR的表達(dá)來(lái)參與顆粒細(xì)胞和卵泡發(fā)育調(diào)控。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)在小鼠卵巢中miR-143表達(dá)于初級(jí)、次級(jí)和竇性卵泡的顆粒細(xì)胞，并證明在FSH介導(dǎo)的小鼠顆粒細(xì)胞中miR-143沉默顯著增加雌二醇的產(chǎn)生和促進(jìn)顆粒細(xì)胞的增殖，并且miR-143通過(guò)靶向調(diào)控KRAS實(shí)現(xiàn)對(duì)甾體激素合成相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控作用。Zhang等[18]證明在牛卵巢顆粒細(xì)胞中FSHR是miR-143的靶基因，miR-143通過(guò)下調(diào)FSHR的表達(dá)減少孕酮的合成和雌二醇的分泌。本研究發(fā)現(xiàn)miR-143過(guò)表達(dá)促進(jìn)FSH介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞孕酮的合成，提示FSH可能通過(guò)調(diào)控miR-143的表達(dá)調(diào)控顆粒細(xì)胞的功能。我們的結(jié)果進(jìn)一步豐富了FSH對(duì)miRNA以及miRNA對(duì)顆粒細(xì)胞孕酮合成的調(diào)控。

綜上所述，本研究表明miR-143能夠促進(jìn)FSH介導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞孕酮的分泌。我們將在上述研究的基礎(chǔ)上，探索miR-143調(diào)控孕酮生成的分子機(jī)制以及與FSH調(diào)控孕酮生成的其他已鑒定通路的關(guān)系，進(jìn)一步揭示miR-143在卵巢顆粒細(xì)胞功能調(diào)控中的作用。