四種精液處理方法優選冷凍精子的比較

陳娟，耿琳琳，盧文紅，張蔚，高麗娜，李琳

(國家衛生健康委科學技術研究所，北京 100081)

近年來不孕不育癥患者呈逐年增加的趨勢，已成為影響人類發展與健康的一個全球性醫學和社會學問題。我國育齡人群中的不孕不育發生率已上升至10%～15%[1]，男性不育占其中的30%～40%[2]。隨著冷凍生物學和輔助生殖技術的不斷發展，供精人工授精(AID)和供精體外受精(IVF-D)作為人類輔助生殖技術之一，成為治療男性不育癥，尤其是無精子癥的重要治療手段[3]。精子優選技術作為AID和IVF-D等輔助生殖技術的主要環節之一，與妊娠結局有著密切的聯系。目前常用的精子優選方法包括，洗滌法(simple washing，SW)、密度梯度離心法(density-gradient centrifugation，DGC)、上游法(swim-up，SU)及磁性活性細胞分選法(magnetic activated cell sorting，MACS)。本文通過比較SW、DGC、SU和MACS四種方法對冷凍精液的優選效果，旨在探討不同精液處理方法對冷凍精液的優選效果，為AID和IVF-D提供可靠的數據。

資料與方法

一、研究對象及試劑、儀器

1.研究對象：收集本中心健康男性志愿者精液標本，并簽署知情同意書。精液入選條件：精液液化時間正常，精液質量符合WHO第5版手冊正常精液標準。

2.實驗儀器及試劑：miniMACSstartingkit和Dead cellremovalkit購于德國美天旎生物技術有限公司；QUINNS Sperm Wash Medium(ART-1006)、PureCeption 24-Determination Bi-Layer Kit(ART-2024)購于秒泉儀器有限公司；精子DNA碎片檢測試劑盒和精子活體染色(伊紅-苯胺黑染色法)試劑盒購于博銳德生物科技有限公司；生物顯微鏡(奧林巴斯CX41，日本)；機械細胞分類計數器。

二、研究方法

1.冷凍精液標本的制備：精液標本液化，2體積標本中加入1體積甘油-卵黃-檸檬酸鹽(GEYC)冷凍保護劑混勻后于30℃孵育10 min，分裝標本，每份標本不少于1 ml，于液氮面懸掛熏蒸10 min后投入液氮內保存。

2. 分組：按照不同的精液優選方法設立4個實驗組，分別是SW組、DGC組、SU組和MACS組，每組隨機使用20例冷凍精液標本。對冷凍精液標本進行復溫解凍，記錄每份冷凍精液優選處理前后的精子濃度、前向運動精子活率、膜完整性、正常形態率及DNA碎片率。

3.精子優選處理：冷凍精液標本預處理：從液氮中提取冷凍精液標本后立刻放入37℃水浴鍋內10 min進行解凍。

洗滌法(SW組)：取1 ml解凍精液標本加入2 ml ART-1006混勻后300g離心5 min，吸取并丟棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內備用。

直接上游法(SU組)：取1 ml解凍精液標本置于15 ml無菌錐形離心管中，在精液上方加入1.2 ml培養液形成液層，離心管傾斜45度，放置37℃溫箱內孵育1 h后保留上層培養液，300g離心5 min后丟棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內備用。

非連續密度梯度法(DGC組)：在15 ml無菌錐形離心管中制備密度梯度液，用ART-2024制備密度梯度分離液，下層為1 ml 80% Isolate，上層為1 ml 40% Isolate。取1 ml解凍精液緩慢加入密度梯度液上層，300g離心20 min，保留下層精子團，加入2 ml ART-1006洗滌后300g離心5 min，吸取并丟棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內備用。

磁珠活性細胞分選法(MACS組)：取1 ml解凍精液，加入80 μl 1×結合緩沖液(每10×106個精子)和20 μl MACS AnnexinV磁珠(每10×106個精子)混勻室溫孵育15 min，加入2 ml ART-1006洗滌，300g離心5 min后去上清，用0.5 ml 1×結合緩沖液重懸，將精子懸液置于磁場分選柱中，結合AnnexinV磁珠的精子被滯留在分選柱中，AnnexinV陰性精子則順柱流出，用0.5 ml 1×結合緩沖液沖洗分選柱，重復3次，收集AnnexinV陰性精子和沖洗液于15 ml無菌錐形離心管，300g離心5 min，棄上清液，加入0.5 ml ART-1006重懸精子沉淀。置37℃溫箱內備用。

4.精液動態學檢測：在高倍鏡下按照前向運動、非前向運動和不活動對精子進行計數，每份精液至少計數200個精子，重復兩次，計算精子濃度、前向運動精子活率。

5.精子形態學檢測：用巴氏染色法對精子進行涂片染色，鏡下觀察200個精子，按WHO第5版手冊方法對精子進行形態學檢查分類，計算精子總畸形率。

6.精子細胞膜完整性檢測：利用精子活體染色法(伊紅-苯胺黑染色法)對精子進行涂片染色，鏡下觀察200個精子，判斷精子細胞膜是否完整，計算精子細胞膜完整率。如圖1所示，精子若細胞膜不完整，則被染為紅色。否則不著色或被染為淺粉色。

L為細胞膜完整精子(頭部為不著色或淡粉色)，D為細胞膜不完整精子(頭部被染為紅色)圖1 精子活性染色(細胞膜完整性檢測)判斷示意圖

7.精子DNA完整性檢測：取60 μl待測精液標本制備精子熔凝膠，制片后室溫放置醋酸溶液(含有0.09%過氧化氫)7 min后移入Tris-HCl緩沖液(含有0.5%十二烷基硫酸鈉SDS)25 min進行裂解變性反應，大量純化水洗滌后，依次用70%、90%、100%乙醇各洗滌2 min，干燥后用瑞士染液進行染色。高倍鏡下觀察500個精子，如圖2所示，精子頭部僅產生較小或者沒有光暈的即為含有DNA碎片的精子，計算精子DNA完整率。

①：精子DNA碎片判定圖示，其中A為精子頭部最小直徑，B為單側光暈厚度，當B≤1/3A則表明精子存在DNA碎片；②、③：DNA完整的精子；④、⑤：存在DNA碎片的精子圖2 精子DNA完整性判斷示意圖

三、統計學處理

結 果

一、不同優選方法前后精子回收率及前向運動活動力參數變化比較

統計結果顯示，精子總數變化方面，4種優選方法前后均有統計學差異(P<0.05)，其中SU組冷凍精子優選前后精子總數變化最大，回收率最低(SW組回收率56.13%，DGC組回收率33.04%，SU組回收率16.77%，MACS組回收率62.87%)。前向運動精子活率方面，DGC和SU組優選后精液的前向運動精子活率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 各組優選前后精子總數及前向運動精子活率比較(-±s)

注：與同組該指標優選前比較，*P<0.05

二、各組精子優選前后形態學變化

統計結果顯示，SW組精液優選前后精子膜完整性、正常形態率及DNA完整率，均無顯著性差異(P>0.05)；DGC、SU和MACS組，優選后精子膜完整率、正常形態率及DNA完整率均顯著高于優選前，差異具有統計學意義(P<0.05)(表2)。瑞士染色結果表明，4種優選方法中，MACS在DNA完整率的優化上更加顯著，優選前后數值為(69.79±3.90)%、(91.95±2.82)%(圖3)。

表2 優選前后精子各項形態參數對比(-±s)

注：與同組該指標優選前相比，*P<0.05

1：優選前；2：SW組；3：DGC組；4：SU組；5：MACS組圖3 優選前后精子SCD實驗圖片(瑞士染色，×40)

討 論

AID和供精IVF-ET作為治療男性不育癥，尤其是無精子癥的重要治療手段，所采用的精液均是經低溫冷凍的精液。新鮮精液經低溫冷凍后細胞完整性及DNA完整性均受到一定程度的損傷[4-5]，對優胚率、種植率及妊娠率造成負影響[6-7]。為了改善妊娠結局，通過精子優選技術去除冷凍精液的雜質、碎片和冷凍保存液，獲得高前向運動精子活率、高細胞形態正常及DNA完整率、少損傷、無凋亡的精子懸液是AID和IVF-D技術中至關重要的環節。

SW法操作簡單，處理時間短，但優選效果較差。本實驗中，SW組，冷凍精子優選前后精子運動活力、膜完整性、正常形態率及DNA完整率均沒有明顯改善，結果與以往新鮮精液的研究[7]一致。DGC組通過離心力的作用使得精液中各種成分在密度梯度溶液柱中達到平衡，而停留在各自的等浮力密度點上，從而分離出正常的精子。分離得到的精子前向運動活率、膜完整率、正常形態率及DNA完整性均得到了改善，結果與以往新鮮精液的優化研究[7-8]一致，但反復長時間離心對精子可能造成一定的損傷[9]。SU依靠精子的活力進行優選，優點是由于純物理作用分離，對精子損傷小，能獲得較高前向運動精子活率、膜完整性、正常形態率及DNA完整性的精子懸液。本研究中，SU組優選后，精子前向運動活率、膜完整率、正常形態率及DNA完整性顯著改善，結果與以往新鮮精液的優化研究[7]一致，但耗時長，精子回收率低，長時間操作易造成精子損傷[9]。MACS的優選原理是將膜聯蛋白V偶聯在微小的磁珠上，將精子混懸液同磁珠混勻孵育，磷脂酰絲氨酸(PS)外翻(凋亡)的精子就會吸附在磁珠上[10]，將此混合液通過具有磁性的MACS分選柱，吸附凋亡精子的磁珠便會吸附在分選柱上，其他精子則會自由通過[11]。MACS可以很好地去除凋亡精子，從而優化冷凍精液的正常形態率、膜完整性和DNA完整率。本研究中，MACS組優選后，精子膜完整率、正常形態率及DNA完整率均顯著高于優選前，結果與以往對于新鮮精液優化的MACS研究結果[12-13]一致。但MACS不能很好地改善冷凍精液的前向運動率。

這4種方法在處理冷凍精子方面各有優缺點，臨床可以根據精液標本的質量或者對于精液制備液的要求來選擇不同的精子優化方法。SW回收率高，但優化效果差，適用于質量好但精子濃度較低的冷凍精子優化，用于AID的治療。DGC可以很好地改善冷凍精液的質量，可以應用于AID/IVF-D/ICIS的治療。SU可以很好地改善冷凍精液的前向運動精子活率、膜完整性和正常形態率，獲得的精子懸液在前向運動精子活率以及正常形態率方面優于其他方法，但回收率較低，故可以應用于精子濃度較高但質量較差的冷凍精子的優化或應用于IVF-D/ICSI治療。4種方法中，MACS可以很好地優選冷凍精液的DNA完整率，但對改善精液前向運動活率沒有顯著成效。越來越多的研究證明精子核DNA的完整度和精子膜的完整度影響受精后的胚胎發育潛能或導致胚胎發育的異常，從而影響輔助生殖技術臨床結局和出生后代的異常[14]，故可以將MACS應用于IVF-D/ICSI的治療，保障具有完整DNA的冷凍精子與卵母細胞受精，從而得到健康后代。目前，已有利用MACS優選新鮮精子后行ICSI成功妊娠并分娩健康嬰兒的報道[15]。

SW、DGC和SU目前已廣泛應用于臨床。MACS對IVF-D/ICSI(尤其是ICSI)的治療有著得天獨厚的優勢[16]，可以保證受精后胚胎發育的潛能及胚胎正常發育，因此認為MACS在輔助生殖領域的應用具有一定前景。但本研究中每個實驗組只使用了20例冷凍精液標本，樣本量少，并且缺乏MACS后精液用于臨床治療的受精率、優胚率及妊娠率等數據。所以對于MACS在輔助生殖領域的推廣還需要開展更大樣本量及多中心的研究加以探討驗證。