黃素化顆粒細胞分離提純方法的比較研究

周小丹，羅金，漆倩榮，謝青貞，鐘方圓，梅憶媛，張祎明

(武漢大學人民醫院生殖醫學中心，湖北省輔助生殖與胚胎發育醫學臨床研究中心，武漢 430060)

卵泡是卵巢的基本功能單位，而顆粒細胞是附著在卵泡腔卵母細胞周圍，構成卵泡的最大細胞群，是卵巢分泌甾體激素的主要功能細胞。顆粒細胞通過間隙鏈接和旁分泌因子影響卵泡及卵母細胞的生長、發育、成熟[1-2]。目前，已有不同研究報道分離提取人卵巢顆粒細胞的各種方法，但結論并不一致。國內有部分研究提出了使用紅細胞裂解法[3-4]，但是國外多數實驗研究仍以密度梯度離心法作為基本方法[5-6]，兩者各具優、缺點。因此，如何有效提取原代顆粒細胞仍是實驗研究的基礎，本文分別選擇這兩種方法及聯合這兩種方法進行提取人卵巢顆粒細胞，從細胞獲取量、存活率、貼壁及細胞生長情況進行比較，為建立分離培養顆粒細胞方法提供更多選擇和依據。

材料和方法

一、研究對象

選取2018年3～4月在我院生殖中心接受IVF-ET治療的20例患者。納入標準：年齡21～38歲；月經第2～3天基礎性激素水平正常；月經第3天竇狀卵泡數在6～20個之間；因輸卵管梗阻或男方因素導致不育；獲卵數>6枚；采卵前陰道分泌物霉菌、滴蟲檢查正常。所有患者均采用黃體期長方案降調節，采卵日收集穿刺取卵和撿卵后廢棄的卵泡液。本研究獲本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

主要試劑：DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司；紅細胞裂解液、Percoll分離液購自武漢Biosharp公司；胎牛血清購自新西蘭Gibco公司；臺盼藍購自福州邁新生物技術開發有限公司；胰酶、PBS緩沖液購自杭州吉諾生物醫藥技術有限公司；免疫組化染色試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司；FSHR抗體購自美國Santa Cruz公司；CCK8試劑盒購自日本同仁。

二、方法

1.材料收集：收集我院采卵患者在B超下經陰道穿刺卵泡獲得的卵泡液，以300g離心10 min，取沉淀用PBS液充分混勻，平分3份提取人卵巢黃素化顆粒細胞。

2.分離純化：(1)密度梯度離心法：5 ml沉淀用PBS配成懸液，以1∶1的比例將細胞懸液緩慢加入到50%Percoll分離液上，以1 800 r/min離心20 min，用巴氏吸管小心吸取中間白色顆粒細胞層，用PBS洗滌1遍，重復上述步驟一次，留取沉淀待消化。(2)紅細胞裂解法：5 ml沉淀加入3倍體積的紅細胞裂解液，37℃孵育5 min后離心，棄上清，若沉淀仍有紅色，可重復上述步驟一次。最后用PBS洗滌1遍，離心棄上清，留取沉淀待消化。(3)密度梯度離心法+紅細胞裂解法：5 ml沉淀用PBS配成懸液，以1∶1的比例將細胞懸液緩慢加入到50%Percoll分離液上，離心，吸取中間白色顆粒細胞層，加入PBS洗滌1次，后按上述紅細胞裂解法進行操作，留取沉淀待消化。(4)消化：將沉淀的黏液團通過200目過濾網過濾，后加入胰酶，輕輕吹打混勻，室溫消化5～10 min以獲取單細胞懸液。然后加入含血清培養基終止消化，離心棄上清，用PBS洗滌1次，留取細胞沉淀待用。

3.細胞計數及存活率檢測：用含10%胎牛血清、1%青霉素和1%鏈霉素DMEM/F12培養液(與后文所提培養液一致)重懸細胞，吸取100 μl重懸的顆粒細胞到一塑料EP管內，加入等體積臺盼藍染色液，輕輕混勻，染色5 min后，用血細胞計數板計數。存活率計算公式：活細胞率=(細胞總數-藍染細胞數)/細胞總數。

4.細胞培養：調整細胞密度為2×105/ml，接種于96孔板，每孔200 μl，設3個復孔，置于37℃、5%CO2培養箱中孵育，用于CCK8測細胞生長曲線。另取細胞沉淀，調整細胞密度為1×106/ml，接種到放置有蓋玻片的12孔板中培養，48 h后換液1次，培養72 h后用于顆粒細胞鑒定。

5.人卵泡顆粒細胞的鑒定：顆粒細胞是女性體內唯一表達卵泡刺激素受體(FSHR)的細胞[7]，本研究采用以FSHR表達作為鑒定顆粒細胞的標準：(1)FSHR免疫組織化學染色：顆粒細胞接種于細胞爬片培養72 h后，細胞爬片用PBS沖洗5 min×3次；4%多聚甲醛固定5 min，PBS沖洗5 min×3次；0.1%Triton通透化處理5 min，3%H2O2去離子水孵育10 min，PBS洗滌5 min×3次；滴加正常山羊血清，孵育15 min，傾去；孵育一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200)，4℃過夜，PBS洗滌5 min；HRP標記的二抗37°孵育45 min，PBS洗滌3 min×3次；用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗；蘇木素復染10 min，鹽酸酒精分色，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。用PBS代替一抗作為陰性對照。(2)FSHR免疫組織熒光染色：細胞固定及通透化處理同免疫組織化學過程相同，通透化處理后用PBS洗滌5 min×3次；滴加適量山羊血清封閉，孵育15 min，傾去；一抗FSHR兔多克隆抗體(1∶200)孵育，4℃過夜，PBS洗滌5 min×3次；孵育熒光二抗(按1∶200稀釋)1 h，PBS洗滌5 min×3次；用DAPI染色液染核5 min，PBS洗滌5 min×3次；抗熒光淬滅封片劑封片，后于熒光顯微鏡下觀察。

6.細胞體外生長曲線：96孔板培養的顆粒細胞分別在孵育后24 h、48 h、72 h、96 h后每孔加入20 μl CCK8溶液，繼續孵育1.5 h。置Rayto酶聯免疫檢測儀(Perkin Elmer公司，美國)上測定450 nm雙波長處吸光度值(OD值)，取3孔OD平均值；以培養時間為橫軸、OD值為縱軸，繪制細胞生長曲線。

三、統計學分析

結 果

一、3種分離方法所得顆粒細胞數及存活率

紅細胞裂解法獲得的顆粒細胞數為(8.3±3.0)×106/ml，顯著多于密度梯度離心+紅細胞裂解法的(3.3±2.2)×106/ml和密度梯度離心法的(2.1±1.6)×106/ml(P<0.05)，密度梯度離心+紅細胞裂解法得到的細胞數稍多于密度梯度離心法，但兩者比較無顯著性差異(P>0.05)。臺盼藍染色后，發現2次密度梯度離心法和密度梯度離心法+紅細胞裂解法獲得的細胞活率均>90%，而紅細胞裂解法獲得的細胞活率為80%～90%。

二、顆粒細胞形態特征及生長狀態

顆粒細胞培養48 h后換液，倒置顯微鏡下觀察，發現顆粒細胞呈多突形或梭形，部分黏成一團，胞內可見黑色顆粒，有部分未貼壁顆粒細胞和少量的紅細胞分散漂浮。密度梯度離心法的貼壁細胞伸出細長偽足，緊密相連，細胞核大，圓形，胞質顆粒均勻豐富，生長旺盛，周邊圍繞著少量未貼壁的細胞(圖1A)。密度梯度離心法+紅細胞裂解法較密度梯度離心法獲得的細胞貼壁數目少，周邊圍繞的未貼壁細胞數目略多(圖1B)。紅細胞裂解法的細胞貼壁數目最少，體積細長，伸出偽足數目少，細胞多分散生長，周邊圍繞多數仍未貼壁的細胞(圖1C)。

三、顆粒細胞鑒定

以FSHR表達作為鑒定顆粒細胞的標準，免疫組織化學染色后，鏡下觀察到陽性細胞表現為細胞膜和胞質呈棕褐色著染，FSHR陰性對照組表現為胞膜和胞質呈深藍色著染，鏡下可見FSHR陽性率均>90%(圖2)，說明3種不同分離方法獲取的顆粒細胞純度達到90%以上。此外，細胞免疫熒光染色方法均檢測到FSHR陽性表達，胞質呈紅染，顆粒細胞陽性率均>90%(圖3)，說明3種方法分離提純的顆粒細胞純度也均達到90%以上。

A：密度梯度離心法；B：密度梯度離心法+紅細胞裂解法；C：紅細胞裂解法圖1 不同分離方法提取的原代顆粒細胞48 h后的生長狀態(×200)

A：密度梯度離心法；B：密度梯度離心法+紅細胞裂解法；C：紅細胞裂解法；D：FSHR陰性對照圖2 體外原代顆粒細胞FSHR免疫組織化學染色結果(×200)

A：密度梯度離心法；B：密度梯度離心法+紅細胞裂解法；C：紅細胞裂解法圖3 體外原代顆粒細胞FSHR免疫熒光染色(×200)

四、顆粒細胞體外生長曲線

3種方法分離提純得到的顆粒細胞，采用CCK8方法檢測并繪制生長曲線圖，發現培養24 h后密度梯度離心法獲得的顆粒細胞貼壁量多于其他兩種方法，繼續培養有明顯的細胞增殖，且細胞存活量均高于其他兩種方法。而紅細胞裂解法獲得的顆粒細胞培養24 h后細胞貼壁量最少且無明顯細胞增殖(圖4)。

五、顆粒細胞傳代后的貼壁、生長狀態

在倒置顯微鏡下觀察，密度梯度離心法提取的顆粒細胞傳代前(圖5A)和傳代24 h后(圖5B)細胞形態發生改變，傳代后的細胞貼壁數目極少，體積小于傳代前的細胞形態，多數未見明顯細長偽足，伸展差，細胞分散生長，并未相互連接、抱團，周邊圍繞多數未貼壁和凋亡的顆粒細胞。

圖4 不同分離方法的顆粒細胞生長曲線

A：傳代前；B：傳代后圖5 密度梯度離心法提取的原代顆粒細胞傳代前及傳代后24 h的生長狀態(×200)

討 論

人卵巢顆粒細胞作為卵巢的最大細胞群，與生殖內分泌功能密切相關，對研究卵母細胞的成熟機制、女性生殖功能、卵巢腫瘤等具有重要的臨床研究意義[8-9]。因此，如何有效分離獲取體外人卵巢顆粒細胞是各種實驗開展的基礎。目前，國內外已有文獻報道的人卵巢顆粒細胞分離提純的方法，主要有紅細胞裂解法和密度梯度離心法。有研究認為紅細胞裂解法是分離提純的最佳選擇[10]，其獲取的顆粒細胞數目遠多于密度梯度離心法，且分泌功能無顯著差異。但國外研究以密度梯度離心法作為分離、提純原代顆粒細胞的主要選擇[11-13]。以往研究多偏重于比較不同方法獲取的細胞數量、活率及實驗效率，很少側重于對細胞貼壁、生長及傳代后的影響。因此，本研究旨在比較并結合這兩種方法的優缺點進行分析，為原代顆粒細胞體外實驗提供最佳的分離選擇方法。

收集的卵泡液中主要混雜紅細胞以及少量白細胞、上皮細胞等。紅細胞裂解法通過裂解紅細胞從而獲取純度相當的顆粒細胞；密度梯度離心法則根據不同細胞比重的差異，借助分離液和離心對細胞進行分離純化，但有部分顆粒細胞與紅細胞黏連而沉于管底，故獲取的細胞數目少于裂解法。實驗結果比較發現3種方法中紅細胞裂解法提取的細胞數目最多，但活率最低；密度梯度離心法雖然獲取細胞數量最低，但活率高；紅細胞裂解法+密度梯度離心法的獲取效果處于這兩種方法之間，但其細胞量仍遠低于紅細胞裂解法。卵巢顆粒細胞是附著于卵泡腔面的復層立方上皮細胞，貼壁能力弱，其貼壁數目決定著細胞未來生長數目。本研究采用密度梯度離心法提取的細胞培養48 h后貼壁數目最多，生長狀態最佳，而紅細胞裂解法獲取的細胞數目最低，狀態最差；紅細胞裂解法+密度梯度離心法獲取的顆粒細胞生長狀態亦處于這兩者之間。基于FSHR在顆粒細胞的特有表達，培養72 h后進行顆粒細胞鑒定，3種方法提取的細胞純度均達到90%以上。本研究中3種分離方法的細胞貼壁狀態提示紅細胞裂解參與的次數越多，細胞的活性和貼壁狀態可能越差；且紅細胞裂解法獲取的顆粒細胞生長曲線呈逐漸下降趨勢，提示顆粒細胞數目在培養過程中逐漸減少，可能是紅細胞裂解液或紅細胞裂解碎片對細胞活性產生了負面作用，此結論與江歡等[14]人的研究結果相似。相比之下，密度梯度離心法獲取的顆粒細胞24 h后貼壁增殖，并在培養48 h后達到生長高峰，72 h后逐漸出現凋亡，這與顆粒細胞在人體內的變化趨勢相一致，說明該方法對細胞生長影響較小；但也有研究認為密度梯度離心后的細胞貼壁不佳，狀態稍差[3]，推測這可能是由于實驗過程中選擇的離心率過大，造成細胞損傷從而影響細胞活率及貼壁生長狀態。此外，本研究對密度梯度離心法獲取的顆粒細胞進行傳代培養，發現和傳代前相比，傳代后的細胞貼壁數目少、種類單一且細胞形態發生變化。因此，從細胞狀態和數量考慮，傳代后的顆粒細胞并不適合體外細胞實驗研究，傳代后的顆粒細胞是否保持原有的細胞功能特性，是否能滿足人原代顆粒細胞體外實驗條件仍需進一步研究。

體外細胞實驗最終的實驗對象主要是貼壁的卵巢顆粒細胞，因此，從最終貼壁的細胞數目和生長狀態考慮，本研究認為密度梯度離心法是分離純化顆粒細胞最佳的選擇方法，紅細胞裂解法+密度梯度離心法并沒有顯示更好的優點。即使為了進一步分離混雜的白細胞，以獲取更高純度的顆粒細胞，密度梯度離心法也是初步分離條件方法的基礎[15]。因此，本研究為進行體外原代顆粒細胞實驗方法的選擇，提供了可靠依據。