雌激素對奶牛乳腺上皮細胞中酪蛋白和甘油三酯表達的影響

■武開樂 庫西塔別克·買買提依不拉音 馬 靜 邵 偉，2 余 雄，2*

（l.新疆農業大學動物科學學院，新疆烏魯木齊830052；2.新疆肉乳用草食動物營養重點實驗室，新疆烏魯木齊830052）

奶牛乳腺上皮細胞是激素在奶牛乳腺中的重要反應器，也是研究乳腺的生長發育和泌乳機制的重要體外模型，因此提高乳腺上皮細胞中乳蛋白及乳脂的合成對生產優質乳具有重要的意義。乳腺的發育是在多種激素的共同調節下完成的[1-2]，雌激素主要是通過機體內一些由不同組織分泌的因子，這些因子通過多種分泌途徑來發揮對乳腺發育的作用[3]。近年來，對于雌激素在畜牧方面的研究，大多集中在反芻動物上，主要是通過飼喂異黃酮類（isoflavone）、木脂素類（lignans）和香豆雌酚（coumestrogen）這幾種結構與動物體內雌激素相類似的物質進行動物實驗。特別是通過動物研究雌激素對奶牛的泌乳性能及乳成分的表達研究已經逐漸開展[4-6]，但在細胞水平上對奶牛乳成分的研究卻很少報道。本研究通過體外培養奶牛乳腺上皮細胞，研究不同濃度雌激素對其乳成分表達的影響，不僅為雌激素在細胞分子水平上對奶牛乳腺上皮細胞的研究奠定基礎，而且可以進一步的為雌激素在提高奶牛的乳成分的表達方面提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

本研究于2018 年2 月至2018 年4 月在新疆肉乳用草食動物營養實驗室進行雌激素調控奶牛乳腺上皮細胞酪蛋白和甘油三酯調控的試驗。將乳腺上皮細胞復蘇后，添加細胞完全培養基，放入37 ℃、5% CO2培養箱培養，選取擴增生長較好的乳腺上皮細胞，分別添加0、50、100、200 μmol/l雌激素孵育BMECs后，在12、24、48、72 h各時間點采用Western Blot方法及高效液相色譜分析法檢測各組細胞中α-酪蛋白（CSN1）、β-酪蛋白（CSN2）及甘油三酯（TG）的表達量。

試驗分為兩組：對照組為單純乳腺上皮細胞培養組，試驗組為不同濃度雌激素添加組。

1.2 主要試驗材料及試劑

奶牛乳腺上皮細胞系（華英生物：支原體檢測為陰性，STR 鑒定結果：Amelogenin：X；CSF1PO：10，12；D13S317：8，9；D16S539：11，12；D5S818：10，13；D7S820：10，11；THO1：8，9.3 ；TPOX：9，11；vWA：15，17）、CO2恒溫培養箱、潔凈工作臺、生物倒置顯微鏡、倒置熒光顯微鏡、離心機、Fresco 低溫冷凍離心機（Thermo）、MultiSkan3 酶 標 儀（Thermo）、酸 度 計pH211（Hanna）、高效液相色譜儀（日本島津2010A）。

MEBM、胎牛血清（Fetal Bovine Serum/FBS）、胰酶、PBS、蛋白抽提試劑（華英生物）、BCA蛋白定量試劑盒（華英生物）、2 mg/ml BSA標準品（華英生物）、5×還原樣品緩沖液（華英生物）、考馬斯亮藍染色液（華英生物）、麗春紅染色液（華英生物）、BSA（Amresco 0332）、PMSF（Amresco 0754）、APS（Amresco 0486）、Tween-20（Amresco 0777）、Bromphenol Blue（Amresco 0449）、NP-40（Amresco M158）、Trizma base（Sigma T1503）、Glycine（Sigma G8898）、Sodium deoxycholate（Sigma D6750）、蛋白酶抑制劑（Roche 11697498001）、甲 醇（國 藥10014118）、璜基水楊酸（國藥10021516）、TCA（國藥80132618）、氯化鈉（國藥10019392）、1，2-丙二醇（華英生物）、乙腈（華英生物）、正己烷（華英生物）、苯甲酰氯（華英生物）、異丙醇（華英生物）、三氯醋酸（華英生物）。

1.3 試驗方法

1.3.1 細胞的純化

將液氮罐中購買的細胞，用鑷子取出，迅速放在已開啟的37 ℃的水浴鍋中，不停地在水中晃動，使其在1 min 內融化。之后將其移至超凈臺內，用移液槍接種至25 cm2（T25）的細胞培養瓶中，加入完全培養基使其再次生長。在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養，待細胞融合度達80%時開始進行擴增純化。

1.3.2 細胞的培養

當細胞融合度達80%左右之后，將舊的培養基棄去，用2～3 ml 磷酸鹽緩沖溶液（PBS）洗兩遍，加入預熱好的0.25%胰蛋白酶1～2 ml進行消化，在培養箱中孵育2～3 min，然后取出來在顯微鏡下一邊觀察一邊輕微地彈下培養瓶底部，讓其細胞脫落。在顯微鏡下觀察到大約70%細胞脫落之后，加入完全培養基終止消化。再用移液槍進行輕微吹打將其余細胞吹打下來。移至離心管中，在2 000 r/min下離心2 min，小心棄去上清液，加入完全培養基并用移液槍打勻，傳到細胞培養瓶中，正常情況下3 d可以長滿培養瓶內部，在此期間換一次培養基。按照上述的培養方法，將細胞純化擴增到第3 代，在加入不同濃度的雌激素，然后將所有細胞樣進行12、24、48、72 h的培養。

1.4 樣品收集

收集對照組及各雌激素濃度添加試驗組在12、24、48、72 h各時間點的細胞樣品，每組設3個平行，3個重復，取樣后將細胞樣品先放置于-20 ℃的冰箱中2 h，后取出放置于-80 ℃的冰箱過夜，再將過夜后的細胞樣品放入液氮罐中保存。將樣品送至北京華英生物技術有限公司檢測奶牛乳腺上皮細胞中α-酪蛋白（CSN1）、β-酪蛋白（CSN2）及甘油三酯（TG）的表達量。

1.5 數據處理

所有原始數據先用Excel 2016 進行整理，用SPSS 22.0 軟件進行單因素方差分析，并用Duncan's法進行多重比較。數據最終計算資料用“平均值±標準差”表示，以P＜0.05 作為差異顯著性判斷標準，P＜0.01作為差異極顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 觀察奶牛乳腺上皮細胞的形態

圖1 奶牛乳腺上皮細胞復蘇后生長的形態

由圖1可以看出，復蘇后正常生長的奶牛乳腺上皮細胞成片連接，呈不規則的鋪路石狀。

2.2 酪蛋白表達量結果

2.2.1 雌激素對CSN1表達的影響

表1 不同雌激素濃度在不同時間段對CSN1表達量的影響（灰度值）

由表1 可知，在12 h 時，與對照組相比，添加50 μmol/l雌激素組其CSN1的表達量極顯著高于對照組（P＜0.01）；在24 h時，與對照組相比，添加100 μmol/l雌激素組其CSN1 的表達量顯著高于對照組（P＜0.05），添加200 μmol/l 雌激素組其CSN1 的表達量極顯著高于對照組（P＜0.01）；在48 h時，與對照組相比，添加100 μmol/l 雌激素組其CSN1的表達量顯著低于對照組（P＜0.05）；在72 h 時，與對照組相比，添加50、100、200 μmol/l雌激素組其CSN1的表達量極顯著高于對照組（P＜0.01）。其余組與對照組間差異均不顯著。

在12 h 時，50 μmol/l 雌激素添加組CSN1 表達量顯著高于200 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05），且極顯著高于100 μmol/l雌激素添加組（P＜0.01），200 μmol/l雌激素添加組CSN1表達量極顯著高于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01）；在24 h時，200 μmol/l雌激素添加組CSN1 表達量極顯著高于50、100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01），100 μmol/l雌激素添加組CSN1表達量極顯著高于50 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01）；在48 h 時，50、200 μmol/l 雌激素添加組CSN1 表達量顯著高于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05）；在72 h時，200 μmol/l雌激素添加組CSN1表達量極顯著高于50、100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01）。其余各濃度組間差異均不顯著。

不添加雌激素時，對照組CSN1 表達量在48 h 時顯著高于其他各時間點（P＜0.05）；添加50 μmol/l雌激素時，12、48、72 h 的CSN1 表達量顯著高于24 h（P＜0.05）；添加100、200 μmol/l 雌激素時，24、72 h 的CSN1 表達量顯著高于12、48 h（P＜0.05）。其余各時間點差異均不顯著。圖2 是各組在不同時間段時細胞CSN1 表達的凝膠圖像。

圖2 不同雌激素濃度在不同時間段時CSN1表達的凝膠圖像

2.2.2 雌激素濃度對CSN2表達的影響

由表2 可知，在48 h 時，與對照組相比，添加200 μmol/l 雌激素組其CSN2 表達量顯著高于對照組（P＜0.05）；在72 h 時，與對照組相比，添加100 μmol/l雌激素組其CSN2 表達量顯著高于對照組（P＜0.05），添加200 μmol/l 雌激素組其CSN2 表達量極顯著高于對照組（P＜0.01）。其余組與對照組間差異均不顯著。

表2 不同雌激素濃度在不同時間段對CSN2表達量的影響（灰度值）

在12 h 時，100 μmol/l 雌激素添加組CSN2 表達量顯著高于200 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05）；在24 h時，100 μmol/l雌激素添加組CSN2表達量顯著高于50 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05）；在48 h 時，200 μmol/l 雌激素添加組CSN2 表達量顯著高于50、100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05）；在72 h 時，200 μmol/l 雌激素添加組CSN2 表達量顯著高于50 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05）。其余組各濃度組間差異均不顯著。

不添加雌激素及添加50 μmol/l雌激素時，在72 h CSN2 表達量顯著高于其他各時間點（P＜0.05）；添加100 μmol/l 雌激素時，在72 hCSN2 表達量顯著高于24 h（P＜0.05），且極顯著高于12、48 h（P＜0.01），24 h時CSN2 表達量顯著高于48 h（P＜0.05）；添加200 μmol/l雌激素時，在72 h 時CSN2 表達量極顯著高于其他各時間點（P＜0.01），在48 h時CSN2表達量顯著高于24 h（P＜0.05），且極顯著高于12 h（P＜0.01），在24 h 時CSN2 表達量顯著高于12 h（P＜0.05）。其余各時間組間差異均不顯著。圖3 是各組在不同時間段時細胞CSN2表達的凝膠圖像。

圖3 不同雌激素濃度在不同時間段時CSN2表達的凝膠圖像

2.3 雌激素對TG表達的影響

由表3 可知，在12 h 時，與對照組相比，添加50 μmol/l 雌激素組其TG 表達量顯著高于對照組（P＜0.05），添加100 μmol/l雌激素組其TG表達量極顯著低于對照組（P＜0.01）；在24 h 時，與對照組相比，添加50 μmol/l 雌激素組其TG 表達量顯著低于對照組（P＜0.05），添加100 μmol/l雌激素組其TG表達量極顯著低于對照組（P＜0.01），添加200 μmol/l雌激素組其TG表達量顯著高于對照組（P＜0.05）；在48 h時，與對照組相比，添加50 μmol/l雌激素組其TG表達量顯著高于對照組（P＜0.05），添加100 μmol/l雌激素組其TG表達量極顯著低于對照組（P＜0.01），添加200 μmol/l雌激素組其TG表達量極顯著高于對照組（P＜0.01）；在72 h時，與對照組相比，添加50 μmol/l雌激素組其TG表達量顯著高于對照組（P＜0.05），200 μmol/l雌激素組其TG表達量極顯著高于對照組（P＜0.01）。其余組與對照組間差異均不顯著。

表3 不同雌激素濃度在不同時間段對TG表達量的影響（灰度值）

在12 h 時，50 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量極顯著高于100、200 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01），200 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量極顯著于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01）；在24 h 時，200 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量極顯著高于50、100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01），50 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量極顯著高于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01）；在48 h 時，200 μmol/l 雌激素添加組TG表達量顯著高于50 μmol/l雌激素添加組（P＜0.05），且極顯著高于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01），50 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量極顯著高于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01）；在72 h 時，200 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量極顯著高于50、100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.01），50 μmol/l 雌激素添加組TG 表達量顯著高于100 μmol/l 雌激素添加組（P＜0.05）。其余各濃度添加組間差異均不顯著。

不添加雌激素時，對照組在24 h 時TG 表達量極顯著高于其他各時間點（P＜0.01），在72 h 時TG 表達量極顯著高于12、48 h（P＜0.01）；在添加50、100 μmol/l雌激素時，24、72 h時TG表達量顯著高于12、48 h（P＜0.05）；在添加200 μmol/l 雌激素時，24、72 h 時TG 表達量極顯著高于12、48 h（P＜0.01）。其余各時間點組間差異均不顯著。

3 討論

3.1 雌激素對乳腺上皮細胞中CSN1表達的影響

本實驗研究表明，添加雌激素與對照組相比可以促進CSN1的表達。乳腺上皮細胞是乳腺實質腺泡和導管系統的重要組成部分[7]，雌激素可以促進乳腺導管的延伸及乳腺上皮細胞的增殖，進一步促進乳腺分泌乳汁。乳汁中，重要的營養成分之一就是乳蛋白，主要含有乳清蛋白和酪蛋白[8]。隨著對激素調控乳腺上皮細胞研究的逐漸深入，雌激素能夠促進CSN1 表達的原因可能是雌激素可以激活細胞內與其有關的一些信號傳導通路，而這些通路的激活可能與乳腺上皮細胞合成及分泌CSN1的能力有關[9]。楊建英、艾曉杰等[10-11]給荷斯坦牛飼喂大豆黃酮（植物類雌激素）的研究發現，大豆黃酮能夠明顯的提高牛乳中乳蛋白的含量。在對山羊乳腺的研究中發現，當注射17 β-雌二醇后，可誘導提高乳腺上皮細胞分泌α-酪蛋白的能力[12]。與本試驗結果一致。

在50、100、200 μmol/l雌激素添加組中，200 μmol/l高濃度雌激素添加組在24、48、72 h 三個時間段的CSN1的表達量均顯著或極顯著高于50、100 μmol/l雌激素添加組在這段時間內CSN1的表達量。說明高濃度雌激素添加組能夠隨時間的增長，更好的促進CSN1 的表達?？赡苁且驗榇萍に氐臐舛壬吆?，大量的雌激素與其特異性受體發生結合后，誘導乳腺上皮細胞分泌了一些細胞因子，這些因子可能促進了乳腺上皮細胞的增殖，間接的影響了CSN1 的合成[13-14]。盧志勇等[15-17]也做出了同樣的結果，他們的研究發現，加入高添加劑量的大豆異黃酮可以使酪蛋白的表達量明顯提高，且呈現一定的劑量依賴性趨勢。

隨著時間的逐漸增加，100、200 μmol/l 雌激素添加組CSN1的表達量呈先上升，48 h時下降，72 h時又再次升高的趨勢。這種現象的出現可能與細胞自身合成CSN1 的過程及能力有關，高濃度雌激素添加組在72 hCSN1 的表達量再次升高，可能是改變了細胞內CSN1 的合成模式。具體的機制還不清楚，有待于進一步深入研究。

3.2 雌激素對乳腺上皮細胞中CSN2表達的影響

研究表明，添加雌激素與對照組相比可以促進CSN2的表達。酪蛋白是研究激素對乳腺細胞作用的標志，占乳蛋白的80%[18]，它是乳腺特有的合成蛋白，其他細胞不能夠合成。乳腺上皮細胞是合成和分泌乳汁的基本場所。CSN2只在乳腺上皮細胞中分泌[19]，雌激素能夠促進CSN2 的表達，可能是因為雌激素可以增強細胞的抗氧化性，減緩細胞的衰老及凋亡，從而提高了細胞自身對分泌CSN2所需營養物質的轉化速率，也可能是雌激素可以刺激垂體釋放催乳素來調節乳蛋白的合成[20]。程蕾等[21]對乳成分檢測結果表明，日糧中添加大豆異黃酮200 mg/kg，乳蛋白含量略有提高。李東[22]的研究結果顯示，與對照組相比，經過添加雌激素培養的細胞分泌CSN2 的能力明顯提高。李艷等[23]的研究顯示，當催乳素、胰島素和氫化可的松一起添加時，能顯著的提高β-酪蛋白。這些研究與本試驗的研究結果一致。

200 μmol/l 濃度雌激素添加組CSN2 的表達量在48、72 h時顯著或極顯著高于50、100 μmol/l濃度雌激素添加組。說明高濃度雌激素添加組在培養時間上升后能有效的促進CSN2的表達?？赡苁请S著雌激素和時間的不斷增加，雌激素開始促進乳腺上皮細胞吸收大量的其自身生長所需的營養物質，使乳腺上皮細胞的增殖能力及活力不斷提高，進一步合成和分泌CSN2。這之中具體的作用機制還需進一步的探討研究。

3.3 雌激素對乳腺上皮細胞中TG表達的影響

本試驗研究表明，添加雌激素與對照組相比可以促進TG 的表達。乳脂肪的主要成分為甘油三酯、磷脂和甾醇，是牛奶中主要的能量成分。乳脂肪在體內主要是以甘油三酯的形式存在。雌激素可以促進TG的表達，可能是雌激素通過旁分泌或自分泌的方式分泌了一些細胞因子，這些因子進入到血液后，促進了血液中胰島素樣生長因子（IGF-I）的含量逐漸升高，IGF-I 進一步的作用于下丘腦和垂體，促進垂體分泌了大量的催乳素及生長激素等，這些激素含量的變化直接或間接的引起了乳脂含量的變化[11]，也可能是雌激素通過誘導乳腺上皮細胞，使其自身分泌更多的催乳素，催乳素通過PI3K/AKT 途徑促進了乳脂的合成[24]。艾曉杰、程蕾[11，21]等對乳成分檢測后發現，日糧中添加大豆異黃酮，乳脂肪含量極顯著升高。與本試驗的研究結果一致。

在50、100、200 μmol/l雌激素添加組中，200 μmol/l濃度雌激素添加組在24、48、72 h三個時間段的CSN1的表達量均顯著或極顯著高于50、100 μmol/l 雌激素添加組在這段時間內CSN1的表達量。說明高濃度雌激素添加組能夠隨時間的上升，更好的促進TG 的表達。其原因可能是雌激素作為生理調節劑，隨著濃度的不斷增加，促進大量其他因子的不斷分泌，這些因子進入到血液中，誘發了催乳素，IGF-I及促黃體素等一些內源性激素的水平發生了改變，促進乳腺上皮細胞大量的合成和分泌乳脂。

隨著時間的逐漸增加，各濃度雌激素添加組TG的表達量呈先上升，48 h 時下降，72 h 時又再次升高的趨勢。其具體的機制目前還尚不清楚，有待進一步的研究。

4 結論

綜上所述，添加雌激素可以促進乳腺上皮細胞中CSN1、CSN2 及TG 的表達。且在50、100、200 μmol/l這三種濃度的雌激素添加組中，200 μmol/l 在一定條件下促進CSN1的表達效果最好；100、200 μmol/l雌激素添加組均能夠促進CSN2 的表達，且100 μmol/l 促進CSN2 的表達效果最好，尤其是在12、24 h；50、200 μmol/l 雌激素添加組可以促進TG 的表達，但100 μmol/l雌激素添加組能夠抑制TG的表達。