流式熒光技術聯合檢測多種腫瘤標志物的臨床應用

梁仲城* 李春麗 周培剛 黃艷云

（廣西百色市人民醫院檢驗科，廣西 百色 533000）

近年來惡性腫瘤已成為疾病死因之首，其發病率和病死率有逐年上升的趨勢[1]。全國腫瘤登記中心主任陳萬青發布的2015年中國癌癥統計數據顯示，2015年中國有4292000例新發惡性腫瘤病例和2814000例死亡病例。早期診斷并早期治療是降低惡性腫瘤患者病死率、提高惡性腫瘤患者生存質量的重要途徑，探尋一種惡性腫瘤早期診斷的方法一直是醫學界所關注。腫瘤標志物檢測對診斷和篩查惡性腫瘤有一定的參考意義，可單一指標檢測存在靈敏度低特、異性不強等不足[2]，多種聯合檢測可顯著提高檢測靈敏度和特異性，對腫瘤的早期診斷具有重要的應用價值。流式熒光技術具有高速度、高通量、可并行檢測的生物技術平臺[3]，它有機地整和了編碼微球（color-coded beads）、應用流體學、激光技術、高速數字信號處理器和計算機運算法則，造就了其極高的檢測特異性和靈敏度，廣泛應用于核酸研究、酶學分析、免疫分析、受體和配體識別分析等研究[4]。本研究對本實驗室幾年來使用上海透景生命科技股份有限公司提供的Luminex 200多功能流式點陣檢測系統檢測的421例惡性腫瘤患者、372例良性疾病患者和154例健康體檢者血清中常見的7種腫瘤標志物既AFP、CA125、CYFRA211、CA242、CEA、β-HCG、NSE等含量數據進行回顧性分析，探討多種腫瘤標志物聯合檢測在臨床應用的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料：惡性腫瘤組421例均為百色市人民醫院2012年10月至2016年12月住院及門診患者，其中肝癌109例、胃癌97例、肺癌56例、結直腸癌59例、胰腺癌19例、卵巢癌46例、宮頸癌35例，其中男246例，女175例，年齡23～90歲，平均年齡53歲，均經影像學及組織病理學等相關檢查確診；良性疾病組372例為同期住院及門診患者，其中男182例，女190例，年齡18～92歲，平均年齡52歲；健康體檢組為健康體檢者154名，年齡16～90歲，平均年齡48歲。

1.2 儀器和試劑：上海透景生命科技股份有限公司提供的多功能流式點陣儀（Luminex 200）及配套試劑。

1.3 檢測方法

1.3.1 標本采集：空腹采外周靜脈血3 mL，無溶血、無脂血3000 r/min（離心半徑為16 cm）離心8 min，分離血清當天送檢。

1.3.2 實驗方法：嚴格按上海透景公司提供的《多種腫瘤標志物（7種）定量檢測（流式熒光發光法）試劑說明書》進行操作。

1.3.3 正常參考范圍，見表1。

1.3.4結果判斷標準：超過臨界值即為陽性。

1.4 統計學方法：多項分析結果中有一項以上結果陽性者計為陽性病例結果均正常者計為陰性病例，分組別統計陽性例數，應用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，以率表示計數資料，顯著性檢驗采用卡方檢驗（P＜0.05）。

2 結 果

2.1 惡性腫瘤組與良性疾病組、健康體檢組陽性率的比較：多種腫瘤標志物聯合檢測惡性腫瘤組陽性率為73.63%；良性疾病組陽性率為28.77%；健康體檢組陽性率為7.23%。惡性腫瘤組陽性率顯著高于良性疾病組和健康體檢組（χ2=159.48，P＜0.01，χ2=202.14，P＜0.01）。各種腫瘤標志物在各組檢測陽性率見表2。

表1 7種腫瘤標志物正常參考范圍

表2 各種腫瘤標志物在各組中陽性率的比較（%）

2.2 腫瘤組與非腫瘤組（良性疾病組和健康組）多種聯合檢測陰陽性例數比較：多種聯合檢測檢出惡性腫瘤陽性預測率為73.63%（310/421）；陰性預測率為77.57%（408/526）；靈敏度為72.43%（310/428）；特異性為78.61%（408/519）。

表3 多種聯合檢測腫瘤組與非腫瘤組（良性疾病組和健康組）陰陽性例數比較

3 討 論

惡性腫瘤在我國人口中的病死率為108.39/10萬，占總死亡人數的17.9%，高居死亡原因的第2位。由此可見早期發現、早期診斷并早期治療對腫瘤患者具有重要意義。由于目前臨床常用的腫瘤標志物多為腫瘤相關抗原，這類腫瘤相關抗原并不是腫瘤細胞所特有，正常組織和細胞也有表達，只是表達的量存在差異，某些良性疾病也會有不同程度的升高，不同種腫瘤也可存在相同的腫瘤標志物，一種腫瘤也可以存在多種腫瘤標志物。因此單一標志物檢測存在著特異性不強，陽性率較低等不足，特別是早期腫瘤的檢出率不高等缺點。多種腫瘤標志物聯合檢測可以克服這一缺點[5]。

本實驗使用Luminex 200多功能流式點陣儀檢測7種腫瘤標志物。試劑中7種不同的熒光編碼微球上分別交聯針對AFP、CA125、CYFRA211、CA242、CEA、β-HCG、NSE等7種腫瘤標志物單克隆抗體，并以一定數量混合。血清中的各種腫瘤標志物就會被對應的微球捕獲，然后加入生物素標記的熒光的針對上述各種腫瘤標志物配對抗體及鏈親和素標記的PE混合物。這樣各熒光編碼的微球上就形成了與微球抗體交聯的抗體-腫瘤標志物-生物素標記的配對抗體-鏈親和素標記PE結合物，在多功能流式點陣儀上這些熒光微球在流動鞘液的帶動下單列依次通過紅綠激光，紅色激光用來判定微球的熒光編碼，綠色激光用來測定微球上相應腫瘤標志物的熒光強度，熒光強度與測定成分含量成正比，從而達到快速準確定量檢測的目的。流式熒光技術可以同時檢測幾種蛋白含量，具有使用標本量少、同時多種項目檢測、操作簡單、高通量、線性范圍廣、準確性高、重復性好、靈敏度高等優點。目前，已經被廣泛應用于多種腫瘤標志物的檢測[6-8]，本研究結果表明，使用流式熒光技術聯合檢測AFP、CA125、CYFRA211、CA242、CEA、β-HCG、NSE等7種腫瘤標志物檢出惡性腫瘤陽性預測率為73.63%；陰性預測率為77.57%；靈敏度為72.43%；特異性為78.61%。惡性腫瘤組聯合檢測陽性率為73.6%顯著高于良性疾病組（陽性率28.77%）和健康體檢組（陽性率7.23%）（P＜0.01）。這與李心河等報道的使用C-12型多腫瘤標志物蛋白芯片檢測系統測定分析12種常見腫瘤標志物惡性腫瘤組的陽性率（85.6%）顯著高于良性疾病組（41.2%）及健康體檢組（7.03%）結果相近[5]。究結果發現：惡性腫瘤各組聯合檢測陽性率最高為肝癌組84.40%、其次為胰腺癌組84.21%、再次為卵巢癌組76.09%、陽性率最低為宮頸癌組57.14%。各組聯合檢測陽性率均高于單一標志物檢測陽性率。其中肝癌組、肺癌組、結直腸癌聯合檢測陽性率與對應的單一標志物檢測陽性率比較具有顯著性（P＜0.01），見表2，研究結果與馬經野等報道的采用蛋白芯片系統聯合測定分析12種腫瘤標志物發現：聯合檢測對肝癌、肺癌、結直腸癌、食管癌檢出陽性率均顯著高于其單一腫瘤標志物檢測（P＜0.01）[9]結果相符合。

研究還發現，AFP+CA125+CEA對肝癌診斷的價值較大，CEA+CA125+CA242對消化道惡性腫瘤的診斷陽性率較高，CEA+CA125+CYFRA211（或NSE）聯合診斷有助于肺癌的早期診斷。同時從表2數據發現CEA和CA125屬于廣譜的腫瘤相關標志物，它們在不同腫瘤疾病中都有升高，在一些消化系統良性疾病和婦科良性疾病中也常常會升高，所以良性疾病組和健康體檢組也會出現部分CEA或CA125升高的情況。

綜上所述流式熒光技術具有多項目同時檢測、使用標本量少、操作簡單、高通量、線性范圍廣、準確性高、重復性好、靈敏度高等優點[10]。使用流式熒光技術多種腫瘤標志物聯合檢測對腫瘤檢出陽性率高于其單一腫瘤標志物檢測，對提高腫瘤檢出率和腫瘤早期診斷具有重要的臨床意義。