LC3B和mTOR在口腔黏膜白斑和口腔鱗癌組織中的表達

董小琳 柳志文

口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是口腔中最常見的惡性腫瘤，威脅著人們的健康和生命[1]。而口腔黏膜白斑(oral leukoplakia,OLK)為最常見的癌前病變，研究顯示，OSCC 中約有 17%～35%是由OLK發展而來[2]。早期診斷治療OLK惡變對預防OSCC發生有積極作用。目前已有相當研究證明自噬可通過促進細胞死亡而導致癌變，近年來由于其在細胞穩態中的顯著作用，尤其是在癌癥的發病機制及治療中的作用而備受關注[3]。微管相關蛋白1 輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3，MAP1LC3，LC3)是自噬體膜在形成過程中必不可少的基因，其模型LC3B的含量與自噬發生程度呈正相關，由于其特殊性自噬體及以往在OSCC中表達被選定為研究對象[4],用于衡量自噬活性[5]，雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin， mTOR) 在自噬通路中作為逆向調控者，是負向調節細胞自噬的核心基因。本研究旨在通過檢測上述自噬關鍵基因在OLK和OSCC中的表達，探討其與OLK癌變的相關性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本來源 收集2016-12～2017-11湖南省長沙市湘雅口腔醫院病理科蠟塊，包括OLK組織120 例和OSCC組織30 例。OLK組織根據組織病理學改變劃分為“單純增生”(30 例)和“異常增生”(90 例)，“異常增生”根據其程度劃分為“輕度異常”、“中度異常”和“重度異常”，各30 例，并收集其臨床資料，包括患者年齡、性別、發病部位、是否吸煙及臨床分型。另收集手術切除的正常黏膜20 例，常規石蠟包埋。所有患者術前均未進行激素、化療、放療，且無自身系統性疾病。研究對象均簽署知情同意書并納入研究，本試驗獲得中南大學湘雅二醫院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 兔抗人LC3B(ab48394， 1∶300)、 mTOR(ab32028， 1∶400)抗體(Abcam公司， 美國)； 免疫組化Super Vision試劑盒(SV0002， 武漢博士德生物技術有限公司)； DAB顯色劑盒(NA， 北京嘉美生物科技有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化法檢測LC3B和mTOR的表達 將石蠟標本3 μm 連續切片，烘干，脫蠟、至水，枸櫞酸微波抗原修復， 3% H2O2常溫孵育30 min，避免內源性過氧化物酶活性干擾;磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗， 5% BSA 封閉，加一抗， 4 ℃過夜，復溫后PBS沖洗，滴加聚合HRP標記抗兔IgG 37 ℃孵育30 min，DAB 顯色，蘇木精復染， 1%鹽酸乙醇分化，脫水，透明，封片。用已知的陽性照片作為陽性對照，PBS代替一抗做陰性對照。實驗按試劑盒說明書進行。

1.2.2 免疫組化結果判定 兩人雙盲閱片，隨機選取5 個視野觀察(× 400)，根據染色強度計分及陽性細胞百分比計分對染色結果進行半定量分析，結果取平均值。LC3B 和 mTOR 均以細胞膜和(或)細胞質染成棕黃色為陽性細胞。A：染色強度分為： 0(無染色)， 1(淡黃色)， 2(黃色)， 3(棕黃色)； B：陽性細胞的比例評分：1(0～10%)， 2(10%～50%)， 3(50%～100%)。最后評分為：A×B。 1～3 分為陰性，記(-)，≥4 分為陽性，其中4～5 分記(+)，6～8 分記(++)，9 分及以上記(+++)。

1.3 統計學處理

采用SPSS 17.0統計軟件處理數據。LC3B、mTOR在組織中的表達強度比較采用秩和檢驗，其余計數資料采用卡方檢驗，相關性通過Spearman相關性分析實現。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 LC3B在不同組織中表達

LC3B的表達主要見于上皮基底層、棘層、顆粒層及固有層淺層的細胞，其染色部位主要定位于細胞質及細胞核(圖 1)，在正常口腔黏膜、OLK及OSCC組織中的陽性率分別為85.0%(17/20)、65.8%(79/120)和33.3%(10/30),結果有顯著性差異(P<0.01，表 1)。在OLK各病理分型中，LC3B表達率分別為單純性增生83.3%(25/30)、輕度異常73.3%(22/30)、中度異常56.7%(17/30)、重度異常50.0%(15/30)，差異有統計學意義(P<0.05， 表 1)。

圖 1 LC3B在各組中的表達

2.2 mTOR在不同組織中表達

mTOR的表達主要見于上皮全層，少數見于固有層及結締組織淺層細胞，陽性表達均位于細胞質(圖 2)，在正常口腔黏膜、OLK及OSCC組織中的陽性率分別為20.0%(4/20)、48.3%(58/120)和76.7%(23/30)，結果有統計學意義(P<0.01， 表 1)。而在OLK組織內，mTOR表達率分別為單純性增生36.7%(11/30)、輕度異常40.0%(12/30)、中度異常53.3%(16/30)、重度異常63.3%(19/30),但差異不具有顯著性(P>0.05， 表 1)。

2.3 LC3B和mTOR在組織中表達的相關性

雙變量相關分析, LC3B陽性率的逐漸下降與組織惡性度顯著負相關(r=-1.000，P<0.01)， mTOR 陽性率的逐漸升高與組織惡性度顯著正相關(r=1.000，P<0.01)； LC3B陽性表達率和mTOR 陽性表達率顯著負相關(r=-0.970，P<0.01， 圖 3)。

2.4 LC3B和mTOR在組織中的表達類型及相關性

LC3B和mTOR在組織中的表達有4 種情況,分別將其概括為如下3 種類型(表 2)： 正常表達(LC3B+mTOR-)、單異常表達(LC3B+mTOR+或LC3B-mTOR-)、雙異常表達(LC3B-mTOR+)。隨著組織惡性度的增高, LC3B和mTOR正常表達的病例比率逐漸降低(r=-1.000,P<0.01， 圖 3), 單異常表達以及雙異常表達的病例比率均逐漸增高(r=1.000,P<0.01，圖 3)。雙變量相關分析,正常表達與單異常表達、雙異常表達的病例比率均顯著負相關(r=-0.975和-0.984，P<0.01， 圖 3)，單異常表達與雙異常表達病例比率顯著正相關(r=0.920，P<0.01， 圖 3)。

表 1 LC3B和mTOR在不同口腔組織中的表達強度

注： LC3B：正常黏膜組與OLK組，Z=-2.704，P=0.007； OLK組與OSCC組，Z=-3.791，P=0.000。 mTOR：正常黏膜組與OLK組，Z=-2.649，P=0.008； OLK組與OSCC組，Z=-3.729，P=0.000； OLK單純增生、輕度異常增生、中度異常增生與重度異常增生組間比較， ①：P<0.05； ②：P>0.05

圖 2 mTOR在各組中的表達

注： LC3B與mTOR表達相關性， r=-0.970， P<0.01

2.5 OLK組LC3B和mTOR表達與臨床因素的相關性

表 2結果可見，LC3B和mTOR的表達在患者年齡、性別、病變部位及吸煙史的差異均無統計學意義(P>0.05)，在臨床類型上表現出顯著性差異(P<0.05)。

2.6 OLK與臨床因素的關系

表 3顯示OLK增生程度與患者性別、病變部位、吸煙史及臨床類型的差異均有統計學意義(P<0.05)，在年齡上沒有表現出顯著性差異(P>0.05)。

3 討 論

自噬是真核細胞為維持細胞穩態的一種降解過程，近年來發現，自噬的發生受多種自噬基因調控，該調控機制失調與腫瘤發生、進展等多種病理過程密切相關[6]。LC3B為LC3表達產物LC3A與磷脂酰乙醇胺結合形成的膜型，其含量與自噬發生程度正相關，被認為是判定自噬活性的特異性靈敏標志分子[7]。 有報道LC3B的表達與多種癌癥相關，其中包括乳腺癌、結直腸癌、胃癌和口腔鱗狀細胞癌等[8-9]。PI3K/AKT/mTOR通路是研究最多的一種癌前及致癌途徑， 該通路的過度激活與許多關鍵的癌癥行為有關[10]。其中的關鍵基因mTOR 能感受諸多信號的作用，為自噬功能的中心調控者，逆向調控自噬誘導及自噬體形成。目前，二者在腫瘤領域的研究處于不斷深入中，已有初步研究表明其與宮頸癌[11]、結腸癌[12]等惡性腫瘤中存在相關性，而在OLK惡變中的相關性尚不明確。

表 2 LC3B、 mTOR的表達與白斑臨床因素的關系

表 3 白斑與臨床因素的關系 (n=30)

Tab 3 Correlation of OLK with clinical factors

(n=30)

本研究中LC3B在口腔正常黏膜、OLK及OSCC中陽性率逐漸降低，且在OLK由單純性增生到重度異常增生各分型中，陽性率依次降低，差異性均顯著，表明隨組織惡性程度增加，自噬表達相對不足，推測這種不足可能與其上皮異常增生的嚴重程度有關，提示異型性明顯的細胞可能逃脫了自噬消除甚至抑制了自噬活性,而單純增生中的高水平自噬則起到了保護作用，從而在一定程度上緩解了黏膜的惡變傾向。LC3B陽性率與組織惡性程度呈顯著負相關，表明其失活可以預示口腔黏膜惡變的進程。同時，LC3B隨OLK異常增生程度增大失活增加，提示LC3B失活是存在于癌前病變中的早發事件，可以考慮作為檢測早期癌變的指標之一。

mTOR作為自噬抑制性通路PI3K/AKT/mTOR的關鍵基因，在本研究中的陽性率與口腔黏膜惡性程度呈顯著性正相關，提示PI3K/AKT/mTOR通路的激活[13]可能加速OLK的惡化。在白斑組織中，mTOR隨異常增生程度增大而表達增加，自噬抑制增強，自噬活性降低。但只在單純性增生與重度異常增生間有顯著性差異(P<0.05)，可見mTOR過表達在口腔黏膜惡變進程有預測作用，而在OLK中檢測到mTOR表達量顯著增加說明其癌變性大大增加，因此，也提示對于早期OLK癌變的檢測作用也許并不明顯。在口腔黏膜惡變進程中，LC3B缺失率與mTOR陽性率呈顯著性正相關，說明二者均與口腔癌變進程相關，這與張晶等[11]在宮頸癌的研究結果一致。再進一步分析其相關性發現，不論LC3B、mTOR單獨或者同時異常表達，隨組織惡性程度增加，失活表達(LC3B-、mTOR+)頻率增加。而單異常表達與雙異常表達正相關(P<0.05)，且均與正常表達呈負相關(P<0.05)，說明LC3B與mTOR失活在OLK發展到OSCC過程有協同作用，這一發現在國內外對于OLK惡變研究中未曾有報道。但單異常表達比率始終高于雙異常，因而是否存在疊加關系，并不能完全確定，還需進一步研究。

分析LC3B和mTOR表達與OLK患者臨床因素的關系，發現在年齡、性別、發病部位及吸煙史方面均無統計學意義(P>0.05)，而在臨床類型上差異性顯著(P<0.05)，可見非均質型OLK更易出現LC3B表達的缺失及mTOR的過表達，自噬水平降低的發生率更高，惡性程度也隨之增大，這與以往的研究報道一致。值得注意的是，表 3中將OLK按病理改變分類后，分析其與臨床因素的關系，發現之前無統計學意義的因素，如性別、發病部位、吸煙史與OLK惡變進程有關，結果有統計學意義。分析這種改變產生的原因，一方面，可能由于本研究樣本量相對較小，在LC3B和mTOR表達上未顯現出陽性結果；另一方面，考慮OLK患者中存在自噬水平的差異，而在不同的臨床因素組中，參數分布不均，差異參差不齊，很有可能影響實驗結果。對于年齡因素，均未表現出顯著性差異。雖然50歲以上患者人數比例逐漸增多，且始終高于50 歲以下患者，但沒有統計學意義。且年齡因素在以往報道中也存在分歧，考慮可能受樣本量的限制，也可能受其他不確定因素影響，如患者的文化水平、經濟狀況、健康敏感度等不同，導致就診及時程度不同，因而尚不能斷定出現的陰性結果意味著毫無差異。由于上皮異常增生常見于非均質型白斑中，兩者皆與OLK惡變有關，臨床醫生遇到此類患者應給予高度重視，對于年齡、性別、發病部位及吸煙史，可作為輔助指標，在臨床上也應適當考慮。

綜上所述，本實驗發現自噬相關基因LC3B 和mTOR的異常表達與口腔白斑及其惡變密切相關。隨著病變的進展，LC3B 表達下調，mTOR表達上調，提示自噬缺陷越明顯。臨床上，應警惕非均質型白斑，結合臨床因素，聯合檢測LC3B與mTOR的表達有助于評估口腔白斑進展程度。鑒于本研究尚存在局限性，期待設計嚴謹、樣本量充足的前瞻性研究，深入闡明自噬與白斑惡變間的關系，為臨床工作提供參考。