口腔鱗狀細胞癌中RAF激酶抑制蛋白的表達及其與臨床特點的相關性

包凡 董菲 劉娟

口腔癌為最常見的頭頸部惡性腫瘤，主要發生在口腔黏膜如舌、頰、硬腭、牙齦等處。90%以上的口腔癌是鱗狀細胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC)，口腔鱗狀細胞癌經常發生侵襲和遠處轉移[1]，是一種惡性程度較高的腫瘤。

Raf-1激酶調控著細胞的生長、增殖以及分化，過度活化的Raf-1激酶會促近腫瘤的發生發展。Raf激酶抑制蛋白(Raf kinase inhibitor protein,RKIP)是一種Raf-1激酶的抑制劑，屬于磷脂酰乙醇胺結合蛋白(phosphatidylethanolamine-binding protein,PEBP)家族成員之一。RKIP能夠結合Raf-1從而抑制Raf-1介導的細胞增殖的信號轉導通路[2], 同時還可以調控G蛋白偶聯受體信號通路和NF-κB信號通路[3]。RKIP表達喪失或減少與很多惡性腫瘤的發生發展密切相關,可以作為一種新的腫瘤標志物。研究證實Raf激酶抑制蛋白在肺癌[4]、胃癌[5]、子宮頸癌[6]、卵巢癌[7]、鼻咽癌[8]、胰腺癌[9]等多種惡性腫瘤中表達減少甚至消失,并且與腫瘤的浸襲和遠處轉移密切相關。RKIP表達缺失往往意味著腫瘤的惡性程度較高,遠處轉移的可能性較大，有學者認為RKIP可以作為腫瘤基因治療的新靶點。因而，本研究通過檢測RKIP在口腔癌組織以及非腫瘤組織的表達情況，評估了RKIP在口腔癌患者診療中的臨床價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究報經醫院倫理委員會通過，收集云南省一院2014-01～2016-07病理科病理蠟塊，其中30 例口腔黏膜白斑、 50 例OSCC組織和50 例對應的癌旁正常黏膜組織，以及其中有淋巴結轉移的轉移組織22 例。所有標本經HE染色確定，且所有患者術前均未經放療或者化療。

1.1.2 試劑 RKIP一抗(sc-28837, Santa Cruz, 美國)； 兔specific HRP/DAB (ABC) Detection IHC試劑盒、 DAB顯色試劑盒、 β-actin(北京中杉金橋公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組化法檢測RKIP的表達 福爾馬林固定、石蠟包埋組織， 4 μm厚的組織切片常規失蠟、微波抗原修復20 min， 室溫下3%過氧化氫封閉30 min，PBS沖洗后用10%山羊血清封閉30 min。 RKIP一抗(sc-28837) 稀釋度： 1∶200)4 ℃冷庫孵育組織切片過夜，PBS漂洗3 次；辣根過氧化物酶孵育后通過DAB顯影液顯示著色情況，隨后使用蘇木精復染。以PBS替代一抗作為空白對照。

1.2.2 免疫組化結果評定 每張組織切片用光學顯微鏡(×400)隨機觀察5 個視野，由3 位病理科醫生分別完成并計分。RKIP的表達根據染色強度(0～3 分)和陽性細胞所占百分比來綜合評定，根據參考文獻[9]的標準進行評分。

1.2.3 Western blot(WB)法檢測RKIP蛋白表達 提取手術標本組織總蛋白，定量后與上樣緩沖液混合均勻，100 ℃沸水中煮5 min， SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳后將其轉移到PVDF 膜，封閉液封閉1 h后加入RKIP一抗4 ℃搖床孵育過夜，TBST 洗滌3 次，每次10 min。洗滌后加入二抗常溫孵育2 h后，TBST 洗滌3 次，每次15 min。然后加入顯影液壓片，顯影，拍照。

1.3 統計學分析

結果采用SPSS 18.0軟件進行統計分析，RKIP表達與臨床病理參數之間的相關性分析采用用χ2檢驗。計量資料間差異分析采用單因素方差分析，P<0.05認為有統計學差異。

2 結 果

2.1 RKIP在OSCC中的表達情況

在OSCC周圍的正常組織和口腔黏膜白斑中，RKIP幾乎存在于上皮全層，主要表達在細胞質。在OSCC組織切片中，RKIP主要表達也在細胞質。 50 例原發性口腔癌組織切片中21 例(42.0%)高表達；而相應的50 例癌旁正常組織中36 例RKIP(72%)高表達，口腔黏膜白斑組30 例中有20 例(66.7%)RKIP高表達。癌旁正常組織組與口腔白斑組的RKIP表達沒有顯著性差異，然而，OSCC組相比這兩組RKIP的表達有明顯的下降。

2.2 RKIP在轉移淋巴結中的表達

在22 例發生淋巴結轉的病例中7 例(28%)檢測到RKIP的表達，在28 例沒有發生淋巴結轉的病例中17 例(60.7%)檢測到RKIP的表達，表明RKIP在轉移淋巴結中表達減少甚至消失；同時， 3 例發生淋巴結遠處轉移的組織切片中幾乎檢測不到RKIP的表達。

2.3 WB法檢測RKIP的表達

RKIP在OSCC組、正常組織組、口腔白斑組、淋巴結轉移組都有表達(圖 2)。 RKIP蛋白在正常組和白斑組的表達量明顯高于OSCC組和淋巴結轉移組。RKIP在OSCC組、 淋巴結轉移組、 正常組織組、 口腔白斑組、淋巴結轉移組的蛋白表達量分別為: 0.463±0.010 0、 0.352±0.009、 0.824±0.021、 0.752±0.015； 前2 組與后2 組相比差異有統計學意義(P<0.05)。

圖 1 RKIP在癌旁組織、口腔白斑、 OSCC、轉移淋巴結組織中的表達情況

(×400)

Fig 1 RKIP expression of normal oral mucosa, oral leukoplakia, OSCC and lymph node with metastases of OSCC

(×400)

表 1 RKIP在不同口腔組織中的表達

表 2 RKIP表達與OSCC患者臨床特征之間的相關性

Tab 2 Association between RKIP expression and clinicopathological features in patients with OSCC

臨床指標RKIP表達(%)n高 低高表達率(%)P值性別 男 28 11 17 39.20.163 女 22 10 9 45.4年齡 >55 24 9 15 37.50.543 <55 26 12 13 46.1原發部位 舌 2116 5 76.20.801 頰 129 3 75 硬腭 11 8 3 72.7 牙齦 65 1 83.3病理分化 高 2712 15 44.40.432 低/中 2311 12 47.8T分期 1-2 3817 21 44.70.253 3-4 124 7 33.3N分期 N0 3519 16 54.20.023 N+ 154 11 26.6TNM Ⅰ～Ⅱ 2715 12 55.50.017 Ⅲ～Ⅳ 237 16 30.4

圖 2 蛋白質印跡法(WB)檢測RKIP在不同組織中的表達情況

3 討 論

RKIP是負調控Ras-Raf-Mark-Erk細胞增殖信號傳導通路的蛋白之一，通過與Raf-1激酶的結合，RKIP能夠抑制細胞的過度增殖，維持細胞數量的動態平衡[10]。研究表明，RKIP能夠抑制多種惡性腫瘤的發生發展以及轉移[11-12]。RKIP抑制腫瘤轉移的機制目前尚不清楚，可能RKIP的過表達同樣會抑制轉移相關的基因。Al-Mulla等[13]發現, RKIP在頭頸部正常組織中表達較高，本實驗通過免疫組化法和蛋白質印跡法發現RKIP在口腔正常組織和口腔癌前病變組織(口腔白斑)中高表達，與他們研究結果一致。本研究發現，RKIP在口腔鱗狀細胞癌中的表達顯著減少；在癌癥患者相應的轉移淋巴結中，RKIP的減少更加明顯；在遠處轉移的淋巴結中，甚至沒有RKIP的表達。RKIP表達的喪失與OSCC的遠處淋巴結轉移以及臨床分期相關，但是與腫瘤的原發部位和組織學分級無關，這與Fu 等[11]發現RKIP表達對前列腺癌的組織學分級無關相一致，表明RKIP可以影響OSCC的發展和轉移，但是對OSCC的腫瘤性質沒有影響。RKIP可能是一種口腔鱗狀細胞癌的轉移抑制劑。

本研究結果還發現在OSCC中RKIP的表達喪失與癌細胞遠處轉移之間存在著顯著的相關性，在發生遠處淋巴結轉移的癌組織中RKIP的表達明顯低于沒有淋巴結轉移的原發性癌組織，甚至沒有RKIP的表達。OSCC的遠處淋巴結轉移預示著預后不良、生存時間縮短的臨床結局。以往的研究表明，RKIP表達喪失在神經膠質瘤中預示著腫瘤高度惡性和預后生存期較短[14]，RKIP表達下降在鼻咽癌中往往預示著癌細胞發生淋巴結轉移[15], 磷酸化的RKIP能夠作為肺癌的一種預后因子[4]。所以，低表達的RKIP可能作為淋巴結轉移的OSCC患者預后不良的臨床參考指標之一。

以往的研究發現RKIP在多種腫瘤中發揮著抑制腫瘤轉移的功能，RKIP較少或缺失與腫瘤的侵襲性相關。本研究也發現RKIP的表達缺失與OSCC的的發展和轉移顯著相關,RKIP可能是通過抑制OSCC腫瘤新生血管的生成及抑制腫瘤的血管內侵襲來發揮其抑制腫瘤生長和侵襲的；也可能是對OSCC侵襲轉移的相關基因進行調節，抑制相關的腫瘤轉移信號通路。但RKIP抑制OSCC轉移的具體機制尚不明確，還需要更進一步的研究來探索。