PTH加速下頜升支截骨術(shù)后正畸牙移動過程中RANKL/OPG的表達(dá)

李耀 唐正龍 陳小燕 王冬香 高瓊

近年來，“手術(shù)優(yōu)先”(Surgery-first approach，SFA)在快速改善患者面型縮短治療療程方面引起學(xué)者們關(guān)注，SFA可能通過術(shù)后激活成骨和破骨細(xì)胞相關(guān)因子來調(diào)節(jié)牙槽骨的轉(zhuǎn)換率，加速正畸牙的移動，從而縮短正畸療程[1-2]。正畸牙移動過程中牙周骨組織的改建受多種因素調(diào)節(jié)。甲狀旁腺激素(parathyroid honmone, PTH)能保持血液中血鈣的平衡，并參與骨組織的合成及分解代謝過程[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用PTH可通過調(diào)節(jié)牙周組織的轉(zhuǎn)換率來促進(jìn)正畸牙的移動，然而其調(diào)控機(jī)制尚不明確[4-5]。

正畸牙的移動過程中，同時受到很多成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相關(guān)因子的參與，其中破骨細(xì)胞核因子κB受體活化因子配體(receptor activator nutear factor kappa-B ligand，RANKL)及骨保護(hù)因子(osteoprotegerin，OPG)是細(xì)胞外調(diào)節(jié)骨吸收的關(guān)鍵因子[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)RANKL和OPG在正畸牙移動期間表達(dá)增加，表明它們在牙周組織的重建過程中發(fā)揮重要作用[8-9]。

實驗通過建立兔下頜升支截骨和下頜第一磨牙正畸移動模型，術(shù)后間歇性注射PTH，觀測牙移動速度，檢測RANKL 和OPG在牙周組織中的表達(dá)，探討PTH在正頜手術(shù)后加速正畸牙移動的分子生物學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用48 只6 個月齡的SPF級新西蘭大耳白兔(貴州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心)，雌雄不限，體重(2.5±0.1) kg。隨機(jī)分成實驗組和對照組，每組24只。對照組頸部隔日皮下注射生理鹽水1 ml，實驗組隔日皮下注射 20 μg/kg rhPTH(Tocris公司, 英國)，各組分別于牽牙第5、 7、 14、 21 d時處死6 只實驗動物。

1.2 建立兔下頜升支截骨和正畸牙移動模型

全麻下于兔右側(cè)下頜骨下緣作長約2 cm皮膚切口，切開皮膚、皮下組織、肌肉至骨面，切開骨膜，剝離下頜骨外側(cè)骨膜，于下頜角前區(qū)沿下頜骨升支至乙狀切跡做一弧形截骨線，截骨后在下頜下緣和升支后緣用鈦板(寧波慈北醫(yī)療器械有限公司)作堅固內(nèi)固定。在下頜兩中切牙和術(shù)側(cè)下頜第一磨頸部中下1/3處制備一條固位溝，用0.2 mm的正畸結(jié)扎絲將 N-T拉簧(直徑 0.1 mm)固定于下頜中切牙和下頜術(shù)側(cè)第一磨牙之間，制作成下頜第一磨牙近中移動正畸模型(圖 1)。術(shù)后第一天牽引第一磨牙近中移動，調(diào)拉簧拉力使正畸牽引力值約0.78 N(圖 1)。

圖 1 下頜升支截骨術(shù)+正畸牙移動模型

Fig 1 Orthodontic models of mandibular first molar movement after mandibular ramus osteotomy

1.3 正畸牙移動速度測量

用硅橡膠印模材料取術(shù)側(cè)下頜牙模型，測量各時期第一磨牙牙冠中點與第二磨牙牙冠中點的距離。并計算出牙齒平均移動速度(mm/d)。

1.4 組織獲取及處理

各組實驗動物處死后，截取含下頜第一磨牙及周圍牙周組織的骨塊，其中3 只用4%多聚甲醛固定24 h， 20%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣4周后常規(guī)石蠟包埋。標(biāo)本沿牙體長軸，按施力方向的近遠(yuǎn)中向連續(xù)切取5 μm組織學(xué)切片分別行HE染色、破骨細(xì)胞染色和免疫組化染色；另3 只用RNAlater液保存，用于實時熒光定量PCR檢測。

1.5 免疫組織化學(xué)檢測RANKL和OPG表達(dá)

用免疫組織化學(xué)法檢測正畸牙壓力側(cè)牙周組織中OPG和RANKL蛋白的表達(dá)(武漢博士德生物工程有限公司)。每張切片選擇5 個視野，經(jīng)攝像后存于Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)中，計算并比較各組壓力側(cè)OPG和RANKL蛋白平均吸光度值(A值)。

1.6 實時定量PCR檢測RANKL mRNA和OPG mRNA表達(dá)

截取兔下頜第一磨牙壓力側(cè)近牙冠1/3處3 mm×3 mm×3 mm的牙槽骨組織，在液氮的中磨碎后取約1 mm3組織，磁珠法提取總RNA。取總RNA 13 μl，逆轉(zhuǎn)錄(Transcript First Strand cDNA Synthesis Kit， Roche, 美國)成cDNA， -20 ℃保存。取上下游引物各1 μl、 cDNA模板1 μl混合于反應(yīng)管，添加 5 μl熒光染料SYBR Green I Master(Roche, 美國)，加雙蒸水補(bǔ)成10 μl反應(yīng)體系。將所有反應(yīng)管放入熱循環(huán)儀中(BIO-RAD)，設(shè)定熱循環(huán)儀反應(yīng)條件(95 ℃ 5 min, 95 ℃ 10 s， 58 ℃ 20 s， 72 ℃ 30 s， 45 個循環(huán))。 在60～95 ℃同時對目的基因及內(nèi)參基因進(jìn)行溶解曲線分析。以對照組為準(zhǔn)，采用2-ΔΔct法進(jìn)行數(shù)據(jù)的定量分析，得出各樣本RANKL mRNA及OPG mRNA相對表達(dá)量。RANKL、 OPG qPCR引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計和合成(表 1)。

表 1 引物基因序列

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 23.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 正畸牙移動速度的比較

術(shù)后21 d內(nèi)實驗組下頜第一磨牙的移動速度均大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。且2 組在第7 天正畸牙移動速度都達(dá)到最快，隨后2 組正畸牙移動速度均減慢(表 2)。

表 2 各組移動牙速度 (mm/d)

Tab 2 The speed of tooth movement

(mm/d)

2.2 牙周組織形態(tài)學(xué)觀察和破骨細(xì)胞計數(shù)結(jié)果

在正畸力牽引第5天時實驗組和對照組壓力側(cè)牙周間隙變窄，膠原纖維排列紊亂，可見多個破骨細(xì)胞位于牙槽骨表面的骨吸收陷窩內(nèi)；張力側(cè)牙周韌帶增寬，細(xì)胞成分增多。在正畸力牽引第7天時，牙槽骨改建活躍，壓力側(cè)骨吸收陷窩進(jìn)一步增大、增深，破骨細(xì)胞數(shù)目達(dá)到高峰，且實驗組較對照組明顯(P<0.05)(圖 2)；張力側(cè)牙周韌帶進(jìn)一步增寬，可見成骨反應(yīng)。在正畸力牽引第14 天和21 天時，實驗組和對照組壓力側(cè)骨破骨細(xì)胞逐漸減少；張力側(cè)部分骨小梁排列成片狀，新骨成骨厚度進(jìn)一步增加。

圖 2 術(shù)后牽牙第7 天時實驗牙壓力側(cè)組織形態(tài)

(HE, ×100)

Fig 2 Morphology of periodontal tissues of the tested tooth on the compression side 7 d after treatment

(HE, ×100)

電鏡觀察下頜第一磨牙壓力側(cè)牙根1/3以上的破骨細(xì)胞數(shù)目，發(fā)現(xiàn)實驗組明顯多于對照組(P<0.05)， 2 組同時在第7天達(dá)到峰值(圖 3、 表 3)。

2.3 RANKL/OPG在正畸牙壓力側(cè)牙槽骨中的表達(dá)

RANKL陽性表達(dá)定位于牙周組織成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞的胞漿內(nèi)。加力5～7 d時，壓力側(cè)牙槽骨中RANKL的表達(dá)水平隨時間的增加而增加，第7 天時平均吸光度值最大，隨后逐漸減弱(圖 4)。實驗組染色強(qiáng)度高于對照組(P<0.05)(表 4)。OPG陽性表達(dá)定位于新生骨小梁周圍的成骨細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的胞漿內(nèi)(圖 5)。加力21 d內(nèi)，實驗組染色強(qiáng)度均低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表 5)。加力7 d時陽性表達(dá)達(dá)到峰值，隨后逐漸下。

2.4 RANKL/OPG mRNA在正畸牙壓力側(cè)牙槽骨中的表達(dá)

圖 3 術(shù)后牽牙第7、 14 天時下頜第一磨牙壓力側(cè)破骨細(xì)胞

(TRAP, ×200)

Fig 3 Osteoclasts on the compression side of periodontal tissues 7 and 14 days after operation

(TRAP, ×200)

圖 4 術(shù)后牽牙第7 天時 RANKL在下頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織區(qū)域的表達(dá)

(免疫組化染色, ×400)

Fig 4 Comparison of RANKL expression on the compression side 7 days after operation

(Magnification, ×400)

Tab 4 RANKL expression on the compression side

(A值，

圖 5 術(shù)后牽牙第7 天 OPG在下頜第一磨牙壓力側(cè)牙周組織區(qū)域的表達(dá)

(IHC, ×400)

Fig 5 OPG expression on the compression side on 7 d after operation

(ICH, ×400)

Tab 5 OPG expression on the compression side

(A值，

壓力側(cè)牙槽骨組織中的RANKL和OPG mRNA表達(dá)均在術(shù)后加力第5～7 天有微弱增加，至第7 天達(dá)最高峰，此后逐漸減少。且實驗組RANKL mRNA的表達(dá)高于對照組(P<0.05)。表明正畸牙壓力側(cè)牙周組織中存在較活躍的破骨活性，有利于正畸牙的快速移動(圖 6)。而壓力側(cè)OPG mRNA的表達(dá)結(jié)果相反，對照組OPG mRNA表達(dá)高于實驗組(P<0.05)(圖 6)。反應(yīng)了對照組壓力側(cè)成骨活動較實驗組強(qiáng)，使對照組正畸牙移動速度低于實驗組。

3 討 論

手術(shù)優(yōu)先正頜外科可使骨性牙頜面畸形患者的面型在早期得到明顯的改善，縮短療程，而且能通過激活相關(guān)骨改建因子來調(diào)節(jié)牙槽骨的代謝，促進(jìn)正畸牙的移動[10-11]。 長期以來學(xué)者們在不斷探索加速正畸牙移動的方法和技術(shù)，除了一些手術(shù)方法和物理輔助方法外[12-14]，近來相關(guān)研究表明PTH作為一種重要的骨代謝調(diào)節(jié)激素，主要通過誘導(dǎo)牙槽骨的代謝來影響正畸牙的移動[15]，然而PTH對正畸牙移動的機(jī)制尚不明確。本研究設(shè)想在下頜升支截骨術(shù)后間歇性應(yīng)用PTH可通過加速牙槽骨的代謝及轉(zhuǎn)換水平，從而進(jìn)一步加速正畸牙的移動。研究結(jié)果顯示，應(yīng)用PTH后實驗組下頜第一磨牙近中移動速度快于對照組，實驗組壓力側(cè)牙周組織中破骨細(xì)胞數(shù)量增加，說明實驗組術(shù)后給予PTH加速了牙周骨組織改建，從而使正畸牙移動加速。

圖 6 壓力側(cè)RANKL mRNA及OPG mRNA表達(dá)

Fig 6 Relative expression of RANKL mRNA and OPG mRNA on the compression side

PTH對骨重建的作用會受到給藥方式的影響，連續(xù)注射甲狀旁腺激素主要產(chǎn)生分解代謝效應(yīng)，而間斷注射則主要導(dǎo)致合成代謝作用[16]。Soma等[4]通過建立鼠上頜正畸牙移動模型，持續(xù)應(yīng)用10 mg PTH，結(jié)果顯示應(yīng)用PTH組正畸牙壓力側(cè)破骨細(xì)胞數(shù)目大于對照組，且加快了正畸牙移動，而間隙性應(yīng)用PTH沒有加速正畸牙的移動。Salazar等[17]研究顯示，對卵巢切除術(shù)后骨質(zhì)疏松大鼠應(yīng)用甲狀旁腺激素(30 μg/kg·d)皮下注射后，在第7 天時正畸牙移動速度快于未行卵巢切除術(shù)的對照組，且各組間正畸牙牙周膜間隙和破骨細(xì)胞數(shù)量沒有統(tǒng)計學(xué)差異。本研究模擬下頜升支正頜外科截骨手術(shù)，術(shù)后間歇性皮下注射20 μg/kg PTH，結(jié)果顯示實驗組正畸牙的移動速度快于對照組。說明在下頜升支截骨術(shù)后應(yīng)用20 μg/kg PTH可加速正畸牙移動，但最適的效量關(guān)系任需進(jìn)步一探索。

正畸牙的移動過程中成骨和破骨細(xì)胞因子的相互作用，最終導(dǎo)致壓力側(cè)骨吸收和張力側(cè)骨形成。PTH作為體內(nèi)重要的骨代謝調(diào)節(jié)激素，既能促進(jìn)骨形成，又能促進(jìn)骨吸收，具有雙重調(diào)節(jié)作用。Li 等[5]研究外源性間歇性應(yīng)用PTH后大鼠上頜正畸牙移動速度快于對照組，PTH通過RANKL結(jié)合于破骨細(xì)胞前體的表面，經(jīng)一系列的級聯(lián)反應(yīng)和信號傳導(dǎo)，刺激破骨細(xì)胞形成和骨吸收，同時抑制成骨細(xì)胞的活性，而成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞的相互作用是骨改建的關(guān)鍵，在牙槽骨重建過程中RANKL和OPG為其關(guān)鍵的調(diào)控因子。RANKL與破骨細(xì)胞核因子κB受體激活蛋白(receptor activator of NF-κB，RANK)結(jié)合，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的形成和活化。多種骨吸收細(xì)胞因子和激素，通過不同的信號機(jī)制，都匯合于上調(diào)RANKL的表達(dá)。同時RANKL具有與OPG結(jié)合的能力，OPG競爭性的與細(xì)胞膜表面的RANKL結(jié)合，抑制RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成，從而減少骨吸收[18-19]。Soma 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，短期間斷性注射PTH可通過提高牙槽骨轉(zhuǎn)換率從而加速正畸牙的移動。本實驗通過蛋白水平和分子水平來檢測兔下頜升支截骨術(shù)后正畸牙壓力側(cè)不同時期RANKL及OPG的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實驗組壓力側(cè)牙槽骨中RANKL表達(dá)高于對照組，反應(yīng)了實驗組正畸牙壓力側(cè)牙周組織中存在較強(qiáng)的破骨細(xì)胞活性，加速了壓力側(cè)牙槽骨的分解代謝，有利于正畸牙的快速移動。而壓力側(cè)OPG的表達(dá)結(jié)果則相反，對照組OPG表達(dá)高于實驗組，反應(yīng)了對照組壓力側(cè)成骨活動較實驗組強(qiáng)，一定程度上使對照組正畸牙移動速度低于實驗組。

應(yīng)用外源性PTH可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的增生和分化，提高正頜術(shù)后正畸牙的移動。其可能的作用機(jī)制是在正頜術(shù)后PTH可通過增加RANKL表達(dá)，抑制OPG的表達(dá)，加速骨代謝及骨轉(zhuǎn)換水平，從而促進(jìn)下頜正畸牙的移動。