口腔扁平苔蘚患者血清中神經(jīng)生長因子和P物質(zhì)的表達及意義

汪鷹 孫小琴 柳汀 蔡揚

口腔扁平苔蘚(oral lichen planus， OLP)是一種常見的口腔黏膜慢性炎癥性疾病，目前OLP的病因和發(fā)病機制尚不明確，研究表明，OLP可能是一種由T細胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)性疾病[1]。神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)和P物質(zhì)(substance P，SP)是神經(jīng)和免疫系統(tǒng)之間雙向信號網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子。單獨的NGF并不會引起細胞因子及炎癥介質(zhì)的合成，而經(jīng)過炎癥刺激后，增加NGF則可促進炎癥介質(zhì)的釋放，增強炎癥反應(yīng)[2]。神經(jīng)肽的釋放是神經(jīng)源性炎癥的關(guān)鍵事件，它參與許多炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，過敏和哮喘等的發(fā)生發(fā)展[3-4]。同時，NGF可誘導(dǎo)SP的合成和釋放，二者共同參與炎癥性疾病的發(fā)展過程。有研究表明，NGF及其受體酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TrkA)在OLP中的上調(diào)和活化可以激活磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(pAKt)并挽救上皮細胞的死亡[5]，SP與其受體速激肽1型受體(NK-1R)結(jié)合形成復(fù)合體，可能會促進OLP局部病損組織的免疫障礙，并刺激誘導(dǎo)細胞增殖作用，參與OLP局部病損的形成[6]。本實驗通過檢測OLP患者血清中的NGF和SP表達水平，初步探索NGF和SP在OLP免疫發(fā)病中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選擇2015-12～2017-09就診于貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院口腔內(nèi)科口腔黏膜病專科門診的初診患者30 名(男性11 名， 女性19 名)，經(jīng)臨床和病理診斷確診為OLP,其中非糜爛型15 例， 糜爛型15 例， 年齡27～80 歲，病程1 周～4 年不等。排除其他口腔黏膜疾病，高血壓，糖尿病等系統(tǒng)性疾病及免疫性疾病； 1 個月內(nèi)未使用抗生素； 3 個月內(nèi)未使用任何免疫制劑。 20 例對照組來自體檢中心健康人志愿者，其年齡、性別均與OLP組相匹配。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核批準，所有納入的研究對象均知情同意。

1.2 主要儀器和試劑

高精度移液器(Eppendorf, 德國); Model 680自動酶標儀(BIO-RAD公司, 美國); 超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司); 酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海研輝生物科有限公司)； 流式細胞儀、 6色TBNK檢測試劑盒(BD公司，美國); 特定蛋白分析系統(tǒng)、 免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G/M/A檢測試劑盒、 補體C3/C4檢測試劑盒(Beckman Coulter公司，美國)。

1.3 標本采集及方法

1.3.1 采血分析 早晨9點前采集OLP患者空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血3 ml于EDTA抗凝采血管中，混勻，常溫保存，由貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院中心實驗室采用流式細胞術(shù)分析淋巴細胞亞群的百分比(CD3+、CD4+、 CD8+、 CD19+、 CD16+56)，微生物免疫實驗室采用散射比濁法檢測患者體液免疫指標(1gG、 lgM、 lgA、 C3、 C4),以實驗室標準值為正常對照。實驗室正常指標參考文獻[7]。

1.3.2 血清中SP和NGF的檢測 早晨9點以前采集健康志愿者及OLP患者空腹?fàn)顟B(tài)下的2 ml外周靜脈血至普通非抗凝采血管中，于室溫條件下，低速離心機以3 000 r/min轉(zhuǎn)速，離心10 min后吸取上層血清于已消毒的EP管中，轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱中保存。按照ELISA試劑盒說明書對標本進行測定，根據(jù)繪制的標準曲線，計算待測血清中SP和NGF的濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 OLP患者免疫檢測結(jié)果

2.1.1 OLP患者細胞免疫檢測結(jié)果 OLP患者CD3+、 CD4+、 CD8+低于正常值(P<0.05)， CD4+/CD8+、 CD19+高于正常值(P<0.05)(表 1)。

2.1.2 OLP患者體液免疫檢測結(jié)果 OLP患者IgM的表達水平高于正常值，C3，C4的表達水平低于正常值(P<0.05)(表2)。

表 1 細胞免疫檢測結(jié)果

2.2 OLP患者外周血中SP和NGF的表達水平

OLP組血清中的SP和NGF的含量高于正常組(表 3)； 糜爛型OLP血清中SP和NGF的含量高于非糜爛型OLP和正常組，非糜爛型OLP血清中SP和NGF的含量高于正常組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖 1)。 Pearson相關(guān)性分析顯示， OLP患者血清中SP和NGF的表達水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.937，P<0.01)。

2.3 OLP患者血清中NGF和SP的表達水平與臨床特征的相關(guān)性分析

Spearman相關(guān)性分析顯示，OLP患者血清中SP和NGF的表達水平均與體征計分(r1=0.464，P1=0.01；r2=0.545，P2=0.002)呈正相關(guān)關(guān)系，與癥狀計分無相關(guān)(P>0.05)(表 4)。

2.4 OLP患者血清中SP和NGF的表達水平與免疫水平相關(guān)性分析

Pearson相關(guān)性分析顯示，OLP患者血清中SP的表達水平與CD19+、IgA的含量(r1=0.321，P1=0.016；r2=0.340，P2=0.009)呈正相相關(guān)關(guān)系；NGF的表達水平與CD19+、IgA的含量(r1=0.324，P1=0.015；r2=0.282，P2=0.032)呈正相相關(guān)關(guān)系(P<0.05)(表 5)。

表 2 體液免疫檢測結(jié)果

Tab 2 Humoral immune test results

(mg/L,

表 3 OLP患者血清中SP和NGF的表達

3 討 論

OLP是一種發(fā)生于口腔黏膜的慢性炎癥性自身免疫性疾病，主要影響口腔黏膜組織如頰粘膜、舌背部及牙齦組織。可同時伴有皮膚、指甲及身體其他部位的損害，具有慢性、非自限性、可能發(fā)生惡變的特點[8]。OLP的病因及發(fā)病機制尚不明確，可能與免疫、感染、心理、遺傳等多因素相關(guān)，一般認為OLP是由T淋巴細胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病[9],但目前T細胞的研究不能完全解釋OLP的免疫病因機制。有研究表明：OLP 患者還存在不同程度的體液免疫功能紊亂，以亢進為主[10]。

本研究發(fā)現(xiàn)，OLP患者外周血中CD3+、CD4+均低于正常值，CD8+降低，CD4+/CD8+升高，提示OLP患者處于細胞免疫功能紊亂的狀態(tài)。CD19+表達高低可代表B細胞表達水平，在抗原刺激下，B細胞可分化為漿細胞，通過分泌免疫球蛋白介導(dǎo)體液免疫反應(yīng)[11]。 IgM的升高可能是由于同步B細胞數(shù)量增多及多克隆B細胞的活化增強，從而產(chǎn)生大量免疫球蛋白[12]。同時OLP患者還存在補體C3、 C4降低， 以上均提示，OLP患者外周血中存在體液免疫的紊亂，以亢進為主。

圖 1 血清中NGF和SP的表達

Tab 4 Correlation of SP and NGF levels in serum with OLP severity

指標SPNGFr值P值r值P值體征計分0.4640.0100.5450.002癥狀計分0.1320.4880.0710.707

表 5 OLP患者血清中SP和NGF的表達與免疫相關(guān)性

Tab 5 The correlation between the expression of SP, NGF and the immune system

指標SPNGFr值P值r值P值CD3+0.0580.7680.1210.539CD4+0.1210.5400.2000.308CD8+-0.0600.763-0.0910.644CD19+0.3210.0160.3240.015CD16+56(NK)-0.1490.450-0.2170.268CD4+/CD8+0.1370.4870.2480.203IgG0.2020.2930.1300.502IgA0.3400.0090.2820.032IgM0.0470.8080.0110.957C30.2120.2880.0830.679C40.2190.2630.2000.308

神經(jīng)生長因子(NGF)是一種影響神經(jīng)細胞生長、發(fā)育、存活的多功能神經(jīng)營養(yǎng)因子，可通過與其高親和力受體NrkA結(jié)合發(fā)揮其生物學(xué)功能。大量研究表明，NGF是神經(jīng)和免疫系統(tǒng)之間雙向信號網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵分子[13]。單獨的NGF并不會引起細胞因子及炎癥介質(zhì)的合成，而經(jīng)過炎癥刺激后，增加NGF則可增強炎癥反應(yīng)，促進炎癥介質(zhì)的釋放[14]。炎性細胞因子，如IL-1β，TNF-α和IL-6可誘導(dǎo)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞以及上皮，內(nèi)皮，結(jié)締組織和肌肉細胞中NGF的合成[13]。神經(jīng)肽的釋放是神經(jīng)源性炎癥的關(guān)鍵事件，它參與許多炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，牛皮癬，過敏和哮喘等的發(fā)生發(fā)展[4,15]，從神經(jīng)末梢釋放的神經(jīng)肽如P物質(zhì)可誘導(dǎo)血管擴張和血漿外滲，促進白細胞趨化性和吞噬作用，并可直接影響細胞因子和炎癥介質(zhì)從免疫細胞的釋放[16]。有學(xué)者研究表明，NGF與位于感覺神經(jīng)末梢中的TrkA受體結(jié)合，NGF-TrkA復(fù)合物內(nèi)化，激活影響SP 合成和翻譯的特異性信號通路，從而上調(diào)SP的表達[17]。由此可推測NGF除了可直接影響炎癥反應(yīng)外，還可通過上調(diào)SP，間接影響免疫應(yīng)答。有研究表明,OLP局部病損組織中 NGF的表達含量升高，可促進角質(zhì)形成細胞的增殖，且與局部炎癥進展有關(guān)[18]。本研究中OLP患者血清中NGF和SP的表達水平均高于對照組，且糜爛型高于非糜爛型，NGF與SP的表達成正相關(guān)關(guān)系，推測可能的機制是OLP患者體內(nèi)炎癥細胞因子如IL-6、TNF-α等[19]升高及口腔黏膜組織的損傷可誘導(dǎo)局部組織及外周血NGF的合成，且外周血中的NGF可通過血液循環(huán)作用于局部組織，NGF產(chǎn)生的增多可影響神經(jīng)纖維分布和神經(jīng)元活性，并誘導(dǎo)具有免疫調(diào)節(jié)作用的SP的合成和釋放，二者協(xié)同促進炎癥的發(fā)展，從而參與了OLP病程的進展。

NGF可促進B細胞的增殖反應(yīng)，并調(diào)節(jié)B細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答和免疫球蛋白分泌，促進B細胞分化成可分泌免疫球蛋白的漿細胞，從而發(fā)揮直接的免疫調(diào)節(jié)作用[13]；同時SP也能促進B細胞的增殖及免疫球蛋白的分泌，推測二者協(xié)同促進B細胞產(chǎn)生免疫球蛋白的作用也是其促進及加重免疫炎癥發(fā)生的機制之一。在血液中，IgA結(jié)合免疫效應(yīng)細胞上的FC受體即FcαRI所形成的的免疫復(fù)合物可引起抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性作用，嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞的脫粒，單核細胞，巨噬細胞和嗜中性粒細胞的吞噬作用[20]。至目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)IgA可參與眾多自身免疫性疾病的發(fā)病過程，如IgA腎病[21]，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[22]等。在本研究中，IgA表達略微降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，這與Divya等[23]研究結(jié)果一致，我們推測可能是由于OLP病因復(fù)雜，細胞因子分泌不同，抗原進入機體途徑不同有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，OLP患者血清中CD19+、IgM表達升高，NGF和SP的表達水平與CD19+B細胞及IgA成正相關(guān)關(guān)系，推測在OLP特應(yīng)性免疫應(yīng)答過程中，NGF和SP可能正向通過刺激B細胞增殖和分泌來增加免疫球蛋白含量從而調(diào)節(jié)機體的體液免疫，參與疾病的發(fā)生發(fā)展；血清NGF和SP的表達水平與OLP體征計分呈正相關(guān)關(guān)系，與癥狀計分無相關(guān)，提示NGF和SP的異常表達可能與OLP臨床分型有關(guān)，在OLP疾病進展中發(fā)揮一定的作用；而二者的表達水平與疼痛無明顯相關(guān)性，可能是由于OLP疼痛計分采用VAS計分，存在患者的主觀性因素，也可能是由于納入研究的樣本量過少。

綜上所述， 本研究發(fā)現(xiàn)NGF和SP在OLP中存在異常表達，且與臨床分型有關(guān)，提示在OLP中NGF和SP的異常表達可能共同參與了機體對炎癥性免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用從而促進了OLP的發(fā)生發(fā)展，初步探索了NGF和SP在OLP發(fā)病中的作用，二者為OLP的診斷和治療提供了新的思路，但其具體作用機制還有待進一步研究。