釉基質衍生物改性后的牙本質表面對人牙周膜干細胞的影響

李雪健 王忠山 劉茜 馮曉珂 劉歡 寧瀟 趙銥民

成體干細胞用于人類某些疾病的研究進展迅速，如利用人臍帶間充質干細胞治療活動性類風濕性關節炎已被用于臨床，其安全性和有效性已得到證實[1]，將人牙周膜干細胞(human periodontal ligament stem cells，PDLSCs)應用于牙周缺損的基礎和臨床研究也越來越多。以往大量研究表明[2]，釉基質衍生物在牙齒以礦化發育過程中起到重要作用，且具有較強的促進牙周膜的再生以及誘導無細胞牙骨質形成的能力，而且這種再生形式與組織在胚胎期的原始發育過程類似。在本研究中，首先制備脫礦牙本質支架(treated dentin matrix，TDM)，然后加載不同濃度釉基質衍生物(enamel matrix derivative, EMD)，研究其對人牙周膜干細胞的黏附、增殖、細胞伸展的影響以及分化誘導作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與設備

α-MEM培養基、雙抗、胰蛋白酶(Hyclone, 美國)； I型膠原酶(Gibco，美國)；EDTA溶液胎牛血清(BI，以色列)；CCK-8試劑盒(南京恩晶生物科技有限公司)；低速金剛石切割機(沈陽科晶自動化設備有限公司)；超凈工作臺(山東博科生物產業有限公司)；CO2細胞孵育箱(Thermo Forma, 美國)；釉基質衍生物(Straumann, 瑞士)；倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)；掃描電子顯微鏡(日立，日本)；離心機、反轉錄PCR儀(Eppendorf, 德國)；實時熒光定量分析儀(Bio-rad, 美國)。

1.2 PDLSCs的分離、培養及鑒定

經患者或其監護人簽署知情同意書后，收集18～25 周歲年齡段患者的因正畸需要拔除的前磨牙或埋伏阻生的第三磨牙。無菌環境下，將牙根中1/3處的牙周膜用無菌手術刀片刮下，剪成體積約1 mm3的組織碎片，移至15 ml離心管內，加入濃度為0.2%的I型膠原酶溶液，于37 ℃環境下消化45 min， 其間每隔15 min搖勻1 次，消化后的組織碎片用2 ml α-MEM完全培養基(含10% FBS, 1%雙抗)種入六孔板內，移入細胞孵育箱，在37 ℃、 5% CO2環境下培養，采用有限稀釋克隆法獲取3～5 代PDLSCs用于以下實驗備用。

成骨誘導：取第3 代PDLSCs細胞生長至約90%融合時，更換為成骨誘導液(含10% FBS、 1.8 mmol/L KH2PO4、 10 nmol/L地塞米松和50 μg/mL抗壞血酸的α-MEM培養基)繼續培養， 3 周后茜素紅染色。

成脂誘導：取第3 代PDLSCs細胞生長至約90%融合時，更換為成脂誘導液(含10% FBS、100 nmol/L地塞米松、0.5 mmol/L IBMT、 10 μg/ml胰島素和50 mmol/L吲哚美辛的α-MEM培養基)進行成脂誘導培養， 2 周后油紅O染色。

1.3 脫礦牙本質支架的制備及鑒定

用低速金剛石切割機將所收集離體牙的牙冠部分切割成厚度約1 mm的薄片，利用高速牙科渦輪手機磨除外圍牙釉質，然后分別用0.2、 0.25、 0.5 mol/L的EDTA溶液依次脫礦5 min，每換一次脫礦液用無菌PBS超聲清洗3 次，每次清洗5 min，超凈臺中吹風干燥，紫外線照射過夜，掃描電鏡觀察其表面形態。

1.4 脫礦牙本質支架上釉基質衍生物的加載

首先采用0.1%乙酸溶液溶解一整支EMD-gel,然后將其進一步溶解到α-MEM培養基，配制成0、 50、 100 μg/ml不同EMD濃度的溶液。在無菌操作臺中將24 孔板各孔分為3 組，每組5 孔，每組每孔內分別加入1 ml 不同濃度的EMD溶液，將脫礦牙本質支架置于不同分組，并浸泡48 h后取出，凍干，真空干燥后噴金，掃描電鏡下觀察其表面形態。

1.5 支架上PLDSCs增殖能力檢測

將加載不同濃度EMD的TDM支架置于48 孔板，每組濃度設3 孔，將第4 代PDLSCs以3×103個/孔接種在復合支架上，分別加入含0、 50、 100 μg/ml EMD溶液，利用CCK-8試劑盒測量細胞增殖曲線。

1.6 支架上PLDSCs黏附以及細胞伸展能力觀察

將第4代PDLSCs以1.5×104個/cm3的密度接種于0、 50、 100 μg/ml EMD溶液復合TDM支架上，將每組細胞分別在接種后第30、 60、 120 min用4%多聚甲醛溶液固定15 min，無菌PBS緩沖液清洗，采用DAPI染色觀察不同時間點每組細胞的密度，利用鬼筆環肽染色觀察細胞骨架伸展情況。

1.7 支架上PLDSCs成骨及成牙骨質相關基因表達的檢測

將第4代PDLSCs接種于0、 50、 100 μg/ml EMD溶液復合TDM支架上，分別在第3 天和第7 天收集細胞，Trizol法提取總RNA，RNA質檢合格后反轉錄成cDNA, RT-qPCR法檢測2 組細胞在2 個時間點OCN、ALP、RUNX2、CAP、CEMP-1基因的表達。引物序列見表 1，引物由均北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，以GAPDH為內參，檢測目的基因表達量。

表 1 基因引物序列

1.8 統計學分析

所有數據均采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析， 3 組比較采用方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PDLSCs的培養與鑒定

PDLSCs為長梭型，呈集落樣生長(圖 1A、1B)。成骨誘導21 d后，茜素紅染色后，倒置相差顯微鏡下可見橘紅色鈣化結節形成(圖 1C)；成脂誘導14 d后，油紅O染色后可見紅色脂滴(圖 1D)，證明成功培養出具有多向分化潛能的間充質干細胞。

2.2 TDM支架掃面電鏡結果

切割后的牙本質片未脫礦前可見明顯的玷污層，表面粗糙，遮蓋了牙本質小管(圖 2)，EDTA溶液脫礦后，玷污層被去除，充分暴露牙本質小管，表面相對光滑(圖 2)。

2.3 EMD復合TDM支架掃描電鏡結果

掃描電鏡下觀(圖 3)TDM支架上有大量不規則球狀蛋白聚合物平鋪于表面，部分進入牙本質小管內，直徑約為1～10 μm，其密度隨加載EMD的濃度0、 50、 100 μg/ml依次增加，說明EMD溶液中的各種蛋白能夠沉積到牙本質表面并且進入牙本質小管發揮作用。

2.4 TDM支架對PLDSCs增殖的影響

CCK-8測定的細胞增殖曲線(圖 4)顯示，不同濃度EMD改性的TDM支架對PDLSCs的增殖有不同的促進作用，且存在一定的劑量依賴效應。

2.5 TDM支架上PLDSCs黏附伸展能力

細胞黏附結果(圖 5～6)顯示，第30、 60、 120 min，不同組復合支架上黏附的細胞的數目不同，且隨EMD濃度數值的增加而升高。且在120 min， 相比對照組， 50、 100 μg/ml EMD組的PDLSCs出現了更多的細胞突，伸展程度更明顯(圖 7)，說明EMD改性的TDM支架對PLDSCs的黏附伸展均有促進作用。

圖 1 PDLSCs形態與鑒定

(倒置顯微鏡，×40)

A: Cultured P0 PDLSCs; B: Cultured P3 PDLSCs; C: Alizarin red staining; D: Oil red O staining

Fig 1 Characterization of PDLSCs

(Inverted microscope, ×40)

圖 2 牙本質片表面形態(SEM， ×5 000) 圖 3 EMD復合TDM支架表面形態

(SEM， ×5 000)

Fig 2 Surface morphology of dentin matrix Fig 3 Surface morphology of EMD treated TDM

(SEM, ×5 000) (SEM, ×5 000)

圖 4 PDLSCs增殖曲線

2.6 TDM支架對PLDSCs成骨及成牙骨質相關基因表達的影響

加載EMD后，在第3 天，CAP、CEMP-1成牙骨質相關基因，OCN、ALP、RUNX2成骨相關基因均呈現上調的表達趨勢(圖 8)；在第7 天， 除早期表達的ALP外，其他結果與第3 天相似，提示EMD改性的TDM支架對PLDSCs成骨及成牙骨質相關基因表達有促進作用。

圖 5 PDLSCs接種60 min后DAPI染色熒光顯微鏡下觀

(×100)

Fig 5 PDLSCs stained with DAPI under a fluorescence microscope after 60 min of incubation

(×100)

圖 6 細胞數量對比

圖 7 PDLSCs接種120 min后鬼筆環肽染色熒光顯微鏡下觀

(×100)

Fig 7 PDLSCs stained with phalloidin under a fluorescence microscope after 120 min of incubation

(×100)

圖 8 PDLSCs基因表達

3 討 論

釉基質衍生物的來源為牙齒發育期的成釉上皮細胞以及Hertwig 氏上皮根鞘的內層細胞，其主要成分包括釉原蛋白(amelogenin)，釉蛋白(enamelin)、成釉蛋白(ameloblastin)、釉成熟蛋白(amelotin)和硫化釉蛋白(sulfated enamel proteins)以及一些蛋白酶類[3]。其中釉原蛋白占主要蛋白成分的90%以上，它們可以自組裝成超分子聚合物，形成不溶的細胞外基質，來控制釉質晶體發生過程中的超微結構的形成[4]。基礎研究表明， 釉基質衍生物可以增強T淋巴細胞的增殖和遷移能力[5]，減少細菌的數量[6-7]，從而減弱機體的炎癥狀態；應用釉基質衍生物后，微血管細胞的分化及組織再血管化得到促進，表明其在創傷愈合中的軟組織再生中可以發揮一定作用[8-9]。以釉基質衍生物為主要成分的商品試劑Emdogain?[10]已在其他國家被廣泛應用于牙周缺損治療的各類牙周手術中，其安全性與有效性已得到證實，對牙周組織創傷愈合以及牙周軟硬組織的再生均有促進作用，但釉基質衍生物與人牙周膜干細胞的聯合應用尚未見報道。

脫礦牙本質支架來源于人不再行使功能的牙齒，如因正畸需要拔除的前磨牙或埋伏阻生的第三磨牙，然后通過切割、沖洗、脫礦等工序制備而成。TDM內富含骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)，BMP對血管周的間質干細胞有成骨和成軟骨向的誘導分化作用[11]，TDM有一定的誘導骨形成作用，是一種很好的骨移植材料。在體外實驗中，TDM也是模擬體內牙本質暴露環境的最佳選擇。

本研究首次將釉基質衍生物加載于脫礦牙本質支架上，成功制備了EMD改性的牙本質支架，并對其表面形態觀察，發現EMD能夠沉積于牙本質表面，且進入牙本質小管發揮作用。探究改性后的牙本質支架對牙周膜干細胞的生物學作用結果顯示，其對PDLSCs的黏附、伸展、增殖均有促進作用，且存在一定的濃度依賴效應，此結果對于再生醫學中，組織形成的基礎，種子細胞的生存有著很明顯的意義。同時，細胞內轉錄水平研究表明，EMD改性后的牙本質支架對PDLSCs內成骨及成牙骨質向分化的相關基因的表達均有促進作用。

牙周再生醫學領域中，牙槽骨再生[12]、牙周纖維的再生已有大量研究和進展，但牙骨質的再生一直是世界性的難題，導致很多的牙周缺損治療效果不佳，釉基質衍生物聯合人牙周膜干細胞共同作用有望成為實現牙骨質再生，治療牙周缺損的有效方法。本研究用EMD加載于牙本質支架上，與臨床貼近，進一步模擬了臨床牙周病患者牙本質暴露的環境，在此基礎之上，其對人牙周膜干細胞的生物學作用的意義更加深遠。