柑橘U-box基因家族的鑒定及表達分析

李秋月，張亞飛，彭潔，王旭，張志強，戴祥生，江東，2

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柑橘U-box基因家族的鑒定及表達分析

李秋月1，張亞飛1，彭潔1，王旭1，張志強1，戴祥生3，江東1，2

（1西南大學柑橘研究所，重慶 400712；2中國農業科學院柑橘研究所，重慶 400712；3井岡山農業科技園管理委員會，江西井岡山 343000）

【】通過生物信息學分析U-box在柑橘基因組中的分布、結構及進化，研究家族成員在不同組織中的表達特異性以及對非生物脅迫和激素的響應，解析柑橘U-box基因家族的生物學功能。根據已經報道的擬南芥U-box基因，利用Phytozome數據庫中的BLASTp工具鑒定柑橘基因組中的U-box基因。采用MEGA6.0、Cello、SMART、GSDS2.0、ExPASy和MapChart等軟件構建系統進化樹、亞細胞定位預測、預測蛋白的相對分子質量與等電點等理化性質、繪制家族成員Scaffold定位圖等，分析U-box基因家族在低溫脅迫下表達模式，利用實時熒光定量PCR技術（qRT-PCR）檢測柑橘U-box基因家族部分成員在NaCl、PEG6000和不同激素處理下的表達情況。從柑橘克里曼丁（）全基因組中鑒定出56個基因家族成員，可將其分為7類，即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+WD40-1、TPR+U-box、Kinase+U-box、U-box+ARM-2和U-box+WD40-2。該家族蛋白理論等電點分布在5.19—9.14，編碼的氨基酸數目介于281—1 441；亞細胞定位預測結果顯示該基因家族成員位于細胞不同位置，主要位于細胞核或葉綠體，少數位于質膜；聚類分析發現，柑橘U-box與單子葉植物水稻的親緣關系較遠，柑橘中具有相同結構域的成員和擬南芥具有相同結構域的成員聚在一起，表明柑橘U-box成員具有不同生物學功能；Scaffold定位分析發現，56個U-box成員分布在1—9Scafflod上且呈不均分布。在冷脅迫下的RNA-Seq分析結果表明，U-box基因家族參與植物對冷脅迫的應答，并表現出4種不同的應答模式；從柑橘U-box基因家族的5個不同簇上分別選取1個代表基因進行qRT-PCR，分析結果表明，在金柑的各個組織中均有表達，和CcPUB4主要在莖和花中表達，CcPUB10主要在花、莖和幼果中表達，主要在葉和莖中表達，體現了不同U-box成員的組織特異性的表達差異。CcPUB4和在NaCl脅迫下表達均上調，而在鹽脅迫下的表達無明顯變化。在Na2CO3處理下表達明顯上調，與NaCl處理存在一致的表達趨勢，而CaCl2處理下的表達與NaCl處理下的表達趨勢卻存在差異。在PEG6000的處理條件下，的表達量呈現先上升后下降的趨勢，CcPUB9、和在PEG6000的處理下無明顯變化。在赤霉素（GA3）處理下，CcPUB4在3 h時明顯上調，在生長素（IAA）和脫落酸（ABA）下呈現無規律變化，CcPUB10在ABA處理下表達量表現出逐漸上升。從柑橘克里曼丁全基因組上鑒定出56個U-box基因成員，各成員均含有U-box保守結構域，并位于細胞的不同位置。U-box基因家族參與植物對冷脅迫的應答并表現出4種不同的應答模式，在NaCl、PEG6000和激素處理下，CcPUB4和有不同程度的響應，而CcPUB9和響應不明顯或未響應。

柑橘；基因家族；激素；脅迫；基因表達

0 引言

【研究意義】柑橘是世界范圍內重要的熱帶、亞熱帶經濟類果樹之一，但由于生物脅迫、非生物脅迫等原因嚴重影響了其產量和品質，造成較大的經濟損失。U-box基因參與生物脅迫與非生物脅迫的應答，并對不同的激素處理具有不同的應答模式。本研究利用生物信息學的方法對柑橘全基因組的U-box基因家族進行全面分析，深入了解柑橘生長發育和逆境響應的分子基礎，研究結果對于認識柑橘U-box的功能和進一步培育或改良柑橘抗性品種具有重要意義。【前人研究進展】泛素26s蛋白酶體途徑（ubiquity-26s proteasomepathway，UPP）是目前己知所有真核生物體內具有高度選擇性的蛋白降解途徑[1]，早期的泛素化主要由E1、E2和E3這3種酶來完成。E1激活酶負責激活泛素，E2耦聯酶可直接將泛素轉移到底物蛋白質，或者同泛素一起轉移給E3連接酶[2]。決定底物蛋白特異性識別的E3連接酶，根據作用機理和亞基的組成可以分為4類：單亞基泛素連接酶，包括HECT（homologous to E6-AP COOH-Terminus）、U-box、RING（really interesting new gene）、多亞基泛素連接酶，如cullin-RING（CRLs）[3]。U-box域在植物、動物和酵母等真核生物中高度保守，由70多個氨基酸殘基構成，最早從酵母UFD2（ubiquitin fusion degradation protein-2）中發現[4]。U-box蛋白參與蛋白泛素化降解，同時也對細胞進行自身功能調控，并對生物脅迫、非生物脅迫、生長發育以及對激素做出響應[5-8]。GONZALEZ-LAMOTHE等[9]表明在煙草與番茄中參與多個抗病基因介導的抗性反應；同時，U-box泛素連接酶在低溫、干旱、鹽脅迫及光脅迫等非生物脅迫的過程中發揮重要作用，擬南芥中的、、、，辣椒的及大豆中的響應植物對低溫、高鹽和干旱的相應過程[10-12]；除此之外，一些研究還發現U-box泛素連接酶調控植物的生長發育，BRAUMANN等[13]發現缺失U-box E3泛素連接酶能夠導致brh2和ari-l突變體發生矮化；U-box蛋白可參與植物激素調控通路，擬南芥U-box泛素連接酶與脫落酸（ABA）信號通路有關[14]，在ABA處理下，U-box蛋白在細胞中重新分配，與野生型相比，突變體種子在萌發時對ABA耐受性增強。綜上所述，U-box蛋白具有多種生物學功能，在調節植物的生長發育及生物脅迫與非生物脅迫方面具有重要作用，因此備受研究者的關注。【本研究切入點】U-box基因家族廣泛參與植物生物脅迫與非生物脅迫響應，但目前對U-box家族的研究主要集中在擬南芥、棉花、番茄、水稻和苜蓿等模式植物中，在柑橘中對U-box基因家族進行鑒定和分析尚未見報道。柑橘克里曼丁（）的全基因組測序已經完成[15]，為進一步研究柑橘相關基因的功能及其相互之間的關系奠定了基礎。【擬解決的關鍵問題】本研究利用生物信息學的方法對柑橘U-box基因家族成員進行鑒定，并對該家族的基本信息、保守結構域、Scafflod定位等進行預測分析，利用qRT-PCR技術進行組織表達模式及對非生物脅迫和激素的響應進行表達分析，為闡明柑橘U-box基因家族成員的生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于2018年5—10月在中國農業科學院柑桔研究所資源育種室進行。

1.1 柑橘U-box基因家族成員鑒定

柑橘克里曼丁橘（）的基因組和蛋白組數據下載于公共數據庫Phytozome（https:// phytozome.jgi.doe.gov）；在擬南芥數據庫（http://www. arabidopsis.org/browse/genefamily/pub.jsp）下載擬南芥U-box基因家族基因序列和蛋白序列。利用3種方法鑒定柑橘中的U-box基因。（1）首先以擬南芥中已經鑒定出的64個U-box基因家族成員的蛋白序列在克里曼丁蛋白質組數據庫進行在線BLAST搜索；（2）同時在Pfam數據庫（http://pfam.xfam.org/）中下載所有物種U-box結構域序列（PF04564），利用Hmmer2.3.2（http://hmmer.janelia.org/）構建隱馬氏模型，在Phytozome的克里曼丁蛋白數據庫中搜索含有U-box結構域的序列；（3）合并（1）和（2）的結果，去除無完整讀碼框的序列。將得到的結果使用在線工具SMART（http://smart.embl-heidelberg.de/）進一步分析結構域，去除不包含U-box結構域的序列，最終得到柑橘U-box家族所有基因。將得到的U-box成員按照Scafflod定位進行命名，如：Cc為縮寫，是基因家族的縮寫，1是根據在Scafflod上的位置給這個成員的序號。對柑橘U-box蛋白的分子量和等電點預測使用ExPASy Proteomics Server（http://www.expasy.org/proteomics）。同時用在線軟件MBC（http://cello.life.nctu.edu.tw）對柑橘U-box蛋白進行亞細胞定位預測。

1.2 柑橘U-box家族系統進化及蛋白結構域分析

利用MEGA5.2中的MUSCLE程序將鑒定到的柑橘U-box家族蛋白序列進行多重序列比對，并利用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構建系統進化樹。U-box基因家族蛋白的結構域使用在線工具SMART。

1.3 柑橘U-box家族基因結構及Scafflod定位分析

在phytozome數據庫中下載已鑒定的柑橘U-box基因的DNA序列，用GSDS（http://gsds.cbi.pku.edu. cn/）制作基因結構圖。同時獲得基因的位置信息，基因的Scafflod定位圖用MapChart軟件展示。

1.4 柑橘U-box基因家族的啟動子分析

從克里曼丁全基因組數據庫中提取每個柑橘U-box基因起始密碼子上游2 000 bp基因組序列，順式作用元件預測使用PlantCARE（http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）。

1.5 試驗材料與處理

選用錦橙（Osbeck.）為試材。2018年10月在中國農業科學院柑橘研究所國家果樹種質（重慶）柑橘圃采集錦橙果實，將種子去皮，放在濕潤的培養皿中；然后將其放入28℃的培養箱中進行催芽。選取萌發整齊一致的種子，播種于填裝有混合基質的盆中，置人工氣候箱培養（溫度28℃，光照16 h/黑暗8 h），當第一片真葉充分展開后，選取長勢一致的幼苗進行非生物脅迫和激素處理。激素包括GA3（0.5 mmol·L-1）、ABA（100 μmol·L-1）、IAA（20 μmol·L-1）；非生物脅迫包括高鹽NaCl（300 mmol·L-1）、10%（ω）PEG6000。具體步驟如下：在室溫下，將幼苗洗凈，放入盛有激素或10 μmol·L-1DMSO（激素處理的平行對照）或H2O（非生物脅迫的對照）的滅菌瓶中搖勻，使根系充分接觸液體。分別在處理后的0、3、6、12和24 h收集幼苗，3次生物學重復，放入液氮速凍，-80℃保存備用。

為說明在NaCl條件下是受Na+還是Cl-影響，選用對鹽敏感的大果枳（Raf.），用Na2CO3（6.25 g·L-1）和CaCl2（10.1 g·L-1）進行處理。處理方式同上。

采集同一時期羅浮金柑（Swing）的莖、嫩葉、花、幼果，液氮速凍，-80℃保存，用于分析U-box家族成員表達的組織特異性。

1.6 柑橘U-box家族基因的冷脅迫表達模式分析

在NCBI數據庫中下載枳在冷脅迫、干旱脅迫和鹽脅迫下及4個冷處理下的文庫（GSE67439_pooled- Unigene.fa.gz）并建立本地數據庫，用柑橘U-box家族基因的CDS序列在數據庫中blast，找到相應基因的RNA-Seq編號，然后下載4個冷處理下表達數據，提取出U-box家族基因的表達量數據，利用在線軟件Morpheus（https://software.broadinstitute.org/morpheus/繪制表達量熱圖。

1.7 總RNA提取與cDNA合成

使用RNAprep pure植物總RNA提取試劑盒（DP432，天根）提取植物總RNA。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）（RR047，TaKaKa）試劑盒，將RNA反轉錄成cDNA供熒光定量使用。

1.8 實時熒光定量 PCR

使用Prime3設計引物，引物信息見表1。內參為柑橘-，在CFX96 TouchTM熒光定量PCR儀上對柑橘U-box家族的部分成員的表達量進行分析。擴增體系含2 μL cDNA，上、下游引物各0.5 μL，SYBR 6.25 μL反應Mix，3.25 μL ddH2O，總體系12.5 μL。反應程序為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 34 s，95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，共40個循環。每個處理3次重復。用SPSS軟件進行差異顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

表1 本試驗所用引物

2 結果

2.1 柑橘U-box基因家族成員信息

通過在線BLAST比對以及Hmmer搜索，經過SMART服務器分析去除不含U-box結構域的序列，從柑橘基因組中鑒定出56個U-box基因，并且56個柑橘U-box蛋白均含有62—68個氨基酸的U-box結構域，其中40個U-box蛋白的U-box保守結構域都含有63個氨基酸，表2所示。通過ExPASy工具分析，柑橘中最長的U-box蛋白（Ciclev10024300m）包含1 441個氨基酸殘基，分子量也為56個蛋白質中最大，為160.62 kD，最短的U-box蛋白（Ciclev10032341m）包含281個氨基酸殘基，分子量是56個蛋白中最小的。等電點范圍為5.19（Ciclev10030837m）—9.14（Ciclev10011217m）。利用Cello軟件對柑橘U-box家族成員進行亞細胞定位分析，結果顯示該基因家族成員位于細胞不同位置，其中和定位于質膜，、、、、存在于細胞質，其他成員位于細胞核或葉綠體。

表2 柑橘基因組中的U-box基因

續表2 Continued table 2

2.2 柑橘U-box家族系統進化及蛋白結構域分析

為研究柑橘U-box基因家族系統進化關系，對56個柑橘U-box蛋白構建了系統進化樹，經過SMART蛋白結構域分析，結果顯示除U-box結構域外，柑橘U-box蛋白還含有其他結構域。根據進化樹以及蛋白結構域（圖1），將柑橘中的56個U-box蛋白分為7種類型，即U-box only、U-box+ARM-1、U-box+ARM-2、Kinase+U-box、U-box+WD40-1、U-box+WD4-2和TPR+U-box類，每一類型分別有17、16、5、8、3、2和5個U-box蛋白。U-box only結構的成員在柑橘中最多，共17個。ARM亞家族在植物中研究較多，并在水稻和擬南芥中都為最大亞類[16]，而在柑橘中為第二大亞類。Kinase亞家族有8個成員，其中3個包含有絲/蘇/酪蛋白激酶結構域（STYKc domain），另外5個為絲/蘇氨酸蛋白激酶結構域（S_TKc domain）。同時本研究發現其中76%的U-box家族成員的U-box結構域位于N末端，而U-box結構域位于C末端的成員比較少，U-box結構域位于N末端的聚在一起，位于C端的聚為另一類。位于同一亞家族U-box蛋白含有的結構域種類和數量具有較高的一致性。

為深入研究單子葉植物水稻U-box基因家族與雙子葉植物柑橘和擬南芥U-box基因家族的進化關系，對柑橘（56個）、水稻（77個）和擬南芥（64個）共197個U-box蛋白進行了系統進化樹構建（圖2）。根據親緣關系遠近可將197個U-box蛋白分為7個亞家族，分別含有52、59、46、13、2、3和20個U-box基因。雙子葉和單子葉植物的U-box家族成員在7個亞家族內均有分布。第Ⅰ亞家族和第Ⅱ亞家族含有的結構域較單一，而其他亞家族含有多種不同的結構域。和單獨聚在一個小分支上，在擬南芥中未發現與其高度同源的序列。和進化距離最近，推測其在功能上具有一定的相似性。

Ⅰ：U-box only；Ⅱ：U-box+ARM；Ⅲ：U-box+WD40_1；Ⅳ：TPR+U-box；Ⅴ：Kinase+U-box；Ⅵ：U-box+ARM_2；Ⅶ：U-box+WD40_2

圖2 柑橘、擬南芥和水稻U-box家族蛋白的系統進化樹

2.3 柑橘U-box家族基因結構及染色體定位分析

利用GSDS軟件對U-box家族各成員的基因結構進行了分析。結果顯示（圖3），柑橘U-box家族的基因結構存在較大的差異，外顯子數目為1—16個，內含子數目為0—15個。對基因結構進一步分析發現，U-box only亞家族的基因結構較簡單，一半成員都不含內含子；含有U-box和ARM結構域的成員中多數基因含有3個內含子；含有U-box和Kinase結構域的成員的基因結構極為相似，內含子數目在6—9個；具有U-box和WD40結構域的成員所含內含子數目最多，內含子數在12—15個；含有TPR和U-box結構域的成員含有7個內含子。

根據U-box家族在Scafflod的位置信息，利用MapChart軟件獲得了56個U-box基因在柑橘Scafflod上的分布圖（圖4）。由圖可知，柑橘U-box家族成員在Scafflod上呈不均分布。在3號、6號和8號Scafflod上分布最多，含有8個U-box基因，而1號Scafflod上分布的U-box基因最少，只含有2個U-box成員。進一步分析發現，U-box在Scafflod上呈現區域性，從4號、5號、6號、7號和8號Scafflod中可以看到，在Scafflod上的某個區域家族成員比較集中。

圖3 56個柑橘U-box基因的結構分析

圖4 柑橘U-box基因在Scafflod上的定位（Mb）

2.4 柑橘U-box基因家族的啟動子分析

分析基因啟動子的作用元件可以預測基因的潛在功能，為了解柑橘U-box家族應答生物脅迫和非生物脅迫反應的潛在機制，本研究分析了柑橘U-box家族的啟動子的順式作用元件。結果表明，該家族的啟動子區域富含響應植物激素和逆境脅迫的順式作用元件（表3）。幾乎所有柑橘U-box基因啟動子區至少含有一個植物激素響應元件，包括赤霉素響應元件GARE-motif，乙烯響應元件ERE，MeJA響應元件TGACG-motif和脫落酸（ABA）響應元件ABRE等，51個U-box基因（占總基因數91.1%）至少含有一種生物或非生物脅迫響應元件，非生物響應元件包括光響應元件G-box、低溫脅迫響應元件LTR、冷和脫水響應元件DRE等。

表3 PlantCARE預測CcPUB基因家族啟動子區順式作用原件

2.5 U-box家族基因的表達分析

2.5.1 組織特異性 為了解柑橘U-box基因家族5種結構域（U-box only、U-box+ARM、U-box+WD40、Kinase+U-box、TPR+U-box）的組織表達模式，分別從5種結構域中-選取1個代表基因進行組織特異性分析，利用qRT-PCR分析其在金柑嫩葉、幼果、莖和花中的相對表達量。由圖（5）可看出，這5個基因在各個組織中均有表達。其中和8在幼果中表達量都較低，而CcPUB10主要在幼果中表達，CcPUB4主要在花中表達，CcPUB41和CcPUB48主要在莖中表達。

不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。下同

2.5.2 激素對表達的影響 利用qRT-PCR分析柑橘U-box基因家族中5個代表基因在ABA、GA3和IAA處理下的相對表達量（圖6）。除了CcPUB9、和不響應ABA、GA3和IAA外，CcPUB4和對各處理表現出不同的表達模式。在ABA和IAA處理下，CcPUB4的表達量在0—12 h無明顯變化，在處理24 h后CcPUB4的表達明顯受到抑制，而在GA3處理3 h后表現為上調，的表達量是對照的4倍。在ABA的處理下表達呈現上升的趨勢，而在GA3處理24 h后表達下調，在IAA的處理下無明顯變化。上述結果表明，激素能夠誘導CcPUB4基因的表達。

2.5.3 非生物脅迫對表達的影響 在鹽脅迫條件下，CcPUB4CcPUB9和表達均上調，且CcPUB4、呈現相似的表達趨勢，而的表達不受NaCl的誘導（圖7）。在PEG6000的處理條件下，的表達量呈現先上調后下降，而CcPUB9、和在PEG6000的處理下無明顯變化，在PEG6000條件下無規律變化。

2.5.4 Na2CO3和CaCl2條件下，的相對表達量 由于植物在鹽脅迫的條件下會改變細胞中已有的Na+和Cl-平衡，通過上述的非生物脅迫的結果發現，在NaCl條件下顯著表達，但是并不能確定該基因是受NaCl中哪種離子的影響，因此，采用相同濃度的Na+和Cl-對枳殼進行處理。結果顯示在Na2CO3條件下顯著上調，并且與在NaCl條件下的表達趨勢相似，在CaCl2條件下的表達趨勢卻與在NaCl條件下的表達趨勢不同（圖8）。

圖6 不同外源激素處理條件下CcPUB4、CcPUB9、CcPUB10、CcPUB41和CcPUB48的相對表達量

圖7 非生物脅迫下CcPUB4、CcPUB9 、CcPUB10、CcPUB41和CcPUB48的相對表達量

圖8 在Na2CO3和CaCl2脅迫下CcPUB4的相對表達量

2.5.5在冷脅迫下的表達模式分析 柑橘U-box蛋白可參與調節植物對非生物脅迫的應答，因此，利用枳的RNA-Seq數據分析該基因家族在冷脅迫下的表達模式。在干旱脅迫、鹽脅迫和冷脅迫的RNA-Seq文庫中，找到47個U-box基因序列，其中35個基因在0、6、24和72 h冷脅迫下有表達數據，其他12個在冷脅迫下沒有表達數據（、、、、、、、、、、、）。利用Morpheus繪制35個U-box基因的表達熱圖，分析顯示，這35個基因在冷脅迫下具有表達差異，并且在冷脅迫下具有4種不同的應答模式（圖9），、、、、聚在一分支，在冷脅迫下它們的表達量是先下降再上升；、、、、、和聚在一分支，在冷脅迫下它們的表達量降低；、、、、、、和聚在一分支，在冷脅迫下它們的表達量先上升再下降；、、、、、、、、、、和聚在一分支，該分支的基因都響應冷脅迫，所有基因的表達量都上升。進一步的分析發現，一些進化關系比較接近的U-box基因，在冷脅迫下具有相同的表達模式并聚在一起，如CcPUB40和CcPUB53，CcPUB36和CcPUB37，CcPUB19、CcPUB20和CcPUB21。

圖9 柑橘U-box家族在冷脅迫下的表達譜分析

3 討論

U-box基因家族是一類具有U-box結構域的基因家族，其所編碼蛋白大部分是泛素系統中決定底物識別特性的泛素連接酶E3。從酵母到人類，幾乎所有真核生物都含有U-box蛋白，尤其是植物體內大量存在該類蛋白，如苜蓿中有41個U-box基因[16]，擬南芥基因組中存在64個U-box基因[17]，水稻（）中已鑒定出77個帶有U-box結構的基因[18]，番茄中鑒定出56個U-box基因[19]，雷蒙德氏棉中有93個基因家族成員[20]，人有21個U-box基因[21]。本研究從克里曼丁全基因組數據庫中獲得了56個U-box基因成員，與番茄中U-box成員數相同，而少于擬南芥和水稻中的成員數，表明不同物種的U-box成員數存在差異。雖然番茄的U-box數量與柑橘中的數量一樣多，但其基因組大小約為900 Mb[22]，遠大于柑橘301.4 Mb[15]，由此可見U-box基因家族成員的多少與基因組大小沒有直接關系，這與鄭興衛等[16]在苜蓿U-box基因家族研究中的結論一致。柑橘U-box基因家族的蛋白質大小在31.97—160.62 kD之間，PI在5.19—9.14之間，表明柑橘U-box基因家族成員間的蛋白質大小、PI等特征差異較大。除了含有U-box結構域外，U-box蛋白中還存在ARM、WD40和TPR二級結構域，這些結構域主要用來介導U-box蛋白與底物蛋白的特異性識別。

為了對柑橘中的U-box家族進行功能歸類，利用聚類分析法構建柑橘、水稻和擬南芥的U-box家族系統進化樹，由于U-box基因的保守性，具有相似或者相同功能的基因位于同一組，這為研究該基因家族相關基因的功能提供了可靠的依據。在擬南芥中一些成員的功能已經得到驗證：TPR+U-box亞家族中的參與非生物脅迫調節，在低溫和黑暗條件下，改變應激反應信號轉導中PP2A的活性，從而對非生物脅迫做出響應[23]，柑橘與擬南芥聚在一起，具有較近的親緣關系，猜測TPR+U-box亞家族其他成員在柑橘中起著同樣的作用。U-box+ARM是研究最多的亞家族，屬于U-box+ARM亞家族的、、和在干旱脅迫中起著重要作用[24-25]，能正調控細胞凋亡和植物防御的過程[26]，同時在磷酸鹽饑餓條件下調控側根的發育[27]，由此推測U-box+ARM亞家族其他基因具有相同或相似的功能。U-box only亞家族的基因結構簡單，在植物生長發育和非生物脅迫中發揮重要作用，齊晨輝等[28]發現過量表達的蘋果愈傷組織和異位表達的擬南芥幼苗在鹽脅迫條件下，生長勢與野生型相比明顯變弱，表明負調控鹽脅迫。根據進化關系中基因的同源性，可以推測位于同一組的擬南芥在柑橘中的直系同源基因也可能參與相似的調控途徑。

本研究對單子葉和雙子葉植物中的U-box基因家族成員的進化關系進行分析，單子葉植物和雙子葉植物在7個亞家族中均有分布，說明U-box家族在進化上較保守，U-box家族的起源出現在單雙子葉植物分化之前。本研究發現第Ⅰ亞家族和第Ⅱ亞家族的U-box成員數較多，推測該亞家族中的U-box基因可能在植物的生命進程中發揮了重要的作用。在第Ⅴ亞家族中沒有擬南芥的成員，可能是該亞家族的基因發生了丟失現象。和位于同一聚類組中并且位于相同的染色體上，和也出現這種緊密連鎖，推測在進化的過程中這些基因可能通過染色體內的復制發生了特異性擴張，這些基因的功能有待進一步研究。

U-box基因參與了葉、花、莖和果的生長發育[29-30]，本試驗中的CcPUB10主要在果和花中表達，在葉中幾乎不表達；CcPUB4主要在花和莖中表達，而CcPUB41和CcPUB48在莖中顯著表達，表明柑橘U-box基因調控葉、花、莖和果生長發育。近年來，大量研究表明，E3泛素連接酶是一種極其活躍的激素感知成分，在激素途徑的抑制解除以及激素生物合成的調控中具有重要作用[31]。本試驗通過外施IAA、GA3和ABA激素處理，實時熒光定量結果顯示，在GA3的處理下，上調，在ABA和IAA處理24 h表達受到抑制；在ABA的處理下呈現逐漸上調，在GA3和IAA的處理下無明顯規律。U-box only亞家族的、TPR+U-box亞家族的、U-box+WD40-1亞家族的以及Kinase+U-box亞家族的均受NaCl的影響呈現上調，且在NaCl處理12 h后其表達量是對照的270倍，說明該基因可能參與了植物的鹽脅迫響應，Hwang等[32]抑制擬南芥導致發芽期間對鹽脅迫的耐受性增加，同時，Cho等[33]發現在擬南芥中超表達辣椒的植株耐鹽性增加。在鹽脅迫的條件下可破壞細胞中已有的Na+和Cl-平衡，因此本試驗用Na2CO3和CaCl2對枳殼進行處理，進一步探明是外源的Na+還是Cl-會引起CcPUB4表達量上升，結果顯示在Na2CO3處理下CcPUB4表達明顯上調且和NaCl呈現相似的表達模式，而CaCl2處理只在處理后3 h有較高的表達水平，之后CcPUB4的表達水平降低到正常值，證實了鹽脅迫下，細胞中的Na+平衡被打破。如何在鹽脅迫下發揮作用，是下一步研究的重點內容。CcPUB4在PEG6000下的條件下表達量先上升再下降，其結果與擬南芥的同源基因AtPUB20在干旱脅迫下的結果一致[34]，Seo等[35]研究證實U-box家族中的/和/在干旱脅迫下分別是ABA依賴和ABA非依賴途徑的負調控因子。不同成員間在冷脅迫下具有不同的應答模式。通過對這35個基因的啟動子分析發現，其中17個基因包含冷脅迫響應元件DRE或低溫響應元件LTR，表明對冷脅迫具有響應。其中，在冷脅迫下是上調表達的并且都屬于U-box only亞族，由此預測U-box only亞族在冷脅迫過程中存在著正調控作用，與同源的在冷脅迫下上調[11]，Yee等[36]對擬南芥的U-box家族在冷脅迫下的表達進行分析，發現大多數U-box基因對冷脅迫都具有響應，該結果與本試驗結果一致。在冷脅迫下只有35個U-box基因有表達數據，其他12個沒有在冷脅迫下的表達數據，可能是由于該測序的混合池中包括鹽脅迫和干旱脅迫下的表達數據[37]，這12個基因只在鹽脅迫和干旱脅迫下特定響應。綜上可知，U-box基因家族可能參與了植物激素以及逆境響應調控。對CcPUBs基因家族的啟動子分析發現，其啟動子均含有逆境、激素、溫度等響應順式作用元件如G-box光響應元件、DRE冷和脫水響應元件、MBS、MYB結合位點參與干旱誘導響應元件等，該結果為柑橘U-box基因對逆境和激素的應答機制提供了理論依據。

4 結論

本研究從柑橘全基因組上鑒定出56個U-box基因成員，其蛋白均含有U-box保守結構域。除U-box only亞家族和U-box+ARM-1亞家族部分成員不含內含子外，其余成員均含有內含子，內含子數在0—15個。亞細胞定位顯示柑橘U-box家族基因成員在細胞質、葉綠體、細胞核、細胞質膜中均存在。56個U-box基因分布在1—9號Scaffold且分布不均，U-box基因家族參與植物對冷脅迫的應答，并表現出4種不同的應答模式。實時熒光定量PCR結果表明，柑橘U-box基因家族表達具有組織特異性，且對激素和非生物脅迫有不同程度的響應。

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Genome Wide Identification and Expression Analysis of the U-box Gene Family in Citrus

LI QiuYue1, ZHANG YaFei1, PENG Jie, WANG Xu1, ZHANG ZhiQiang1, DAI XiangSheng3, JIANG Dong1,2

(1Citrus Research Institute, Southwest University, Chongqing 400712;2Citrus Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712;3Management Committee of Jinggangshan Agricultural Science and Technology Park, Jinggangshan 343000, Jiangxi)

【】The objectives of this study were to analyze the distribution, structure and evolution of U-box in citrus genome by bioinformatics, to study the expression specificity of family members in different tissues and their responses to abiotic stress and hormones, and to investigate the biological function of U-box gene family in citrus. 【】According to the reported U-box gene of Arabidopsis thaliana, the U-box gene in citrus genome was identified by BLASTp tool in Phytozome database. Phylogenetic tree, subcellular localization prediction, relative mass and isoelectric point and other physical and chemical properties, and scaffoldlocation of U-box member were analyzed with MEGA6.0, Cello, SMART, GSDS2.0, ExPASy and MapChart, respectively. The expression pattern of U-box gene family under low temperature stress was analyzed, and the expression of some members of U-box gene family in citrus treated with NaCl, PEG6000 and different hormones was detected by real-time fluorescence quantitative PCR (qRT-PCR)【】Fifty-six members ofgene family were identified from the whole genome of, and they could be divided into 7 categories, namely as U-box only, U-box+ARM-1, U-box+WD40-1, TPR+U-box, Kinase+U-box, U-box+ARM-2 and U-box+WD40-2. The theoretical isoelectric point of the family protein was ranged from 5.19 to 9.14, and the number of amino acids encoded was 281 to 1 441. The results of subcellular localization prediction showed that the members of the gene family were located in different positions of the cell, mainly in the nucleus or chloroplast, and a few in the plasma membrane. Cluster analysis showed that citrus U-box was closely related to monocotyledonous rice, and members with the same domain in citrus andwere clustered together. The results showed that U-box members of citrus had different biological functions, and scaffold localization analysis showed that 56 U-box members were unevenly distributed on citrus 1-9 scaffold. The results of RNA-Seq analysis under cold stress showed that U-box gene family was involved in the response of plants to cold stress and showed four different response patterns. One representative gene was selected respectively from five different clusters of citrus U-box gene family for qRT-PCR analysis. The results showed thatwas expressed in all tissues of kumquat, andandwere mainly expressed in stems and flowers,was mainly expressed in flowers, stems and young fruits, andwas mainly expressed in leaves and stems. It reflected the tissue-specific expression difference of different U-box members. The expression of,andwas up-regulated under NaCl stress, but the expression ofhad no significant change under salt stress. The expression ofwas up-regulated under Na-2CO3treatment, which was consistent with that of NaCl treatment, but the expression trend of CaCl2treatment was different from that of NaCl treatment. Under the treatment of PEG6000, the expression ofincreased at first and then decreased, while,anddid not change significantly under the treatment of PEG6000. Under gibberellin (GA3) treatment,was significantly up-regulated at 3 h, while under auxin (IAA) and abscisic acid (ABA), the expression ofshowed irregular changes, and the expression ofincreased gradually under gibberellin (gibberellin) treatment.【】Fifty-six members of U-box gene were identified from the whole genome of. All members contained U-box conserved domain and were located in different positions of cells. U-box gene family was involved in the response of plants to cold stress and showed four different response patterns. Under NaCl, PEG6000 and hormone treatment,andhad different degrees of response, but,andhad no obvious or no response. This experiment provided a theoretical guidance for the further study of U-box gene family in citrus stress resistance and growth and development mechanism.

citrus;gene family; hormone; stress; gene expression

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.11.009

2018-12-29；

2019-02-18

國家重點研發計劃（2018YFD1000101）、重慶市科委重點項目（cstc2016shms-ztzx80004）

李秋月，E-mail：437010037@qq.com。通信作者江東，E-mail：jiangdong@cric.cn

（責任編輯 趙伶俐）