BC200通過介導腦膠質瘤細胞干性的維持抑制替莫唑胺的促凋亡作用

童民鋒，楊帆，劉繼紅，徐虎

（金華市中心醫院 神經外科，浙江 金華 321000）

腦膠質瘤是常見的顱內原發性惡性腫瘤，因其具有高度惡性生物學行為，臨床治療效果往往不佳[1]。替莫唑胺（temozolomide，TMZ）是一種親脂性小分子，能高效透過血腦屏障，引起堿基錯配導致DNA斷裂進而抑制腫瘤細胞生長最終導致細胞死亡，為膠質瘤治療的一線化療藥[2]。越來越多研究發現，腫瘤內存在一部分具有自我更新能力、多向分化潛能及更強體內成瘤能力的細胞—腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）[3]。研究報道，腦膠質瘤干細胞（glioma stem cells，GSCs）是腦膠質瘤對包括TMZ在內的傳統化療耐受的重要因素[4]。如何遏制腦膠質瘤對化療藥物耐受是臨床治療的關鍵所在。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是轉錄長度在200 nt～100 kb的非編碼RNA，許多lncRNA異常表達于腫瘤，并且影響包括腦膠質瘤在內的多種惡性腫瘤發生發展[5]。lncRNA BC200（以下簡稱BC200）是lncRNA大家族的一員，臨床研究顯示其在高侵襲性乳腺癌及卵巢癌、宮頸癌中高度上調[6]，但BC200與腦膠質瘤干性的關系還未有研究報道。本研究以腦膠質瘤U87 MG細胞為研究模型培養分離GSCs，siRNA干擾BC200并觀察GSCs對TMZ的敏感性，為臨床腦膠質瘤治療提供理論支持。

1 材料和方法

1.1 材料 U87 MG膠質瘤細胞系購自中國科學院上海細胞庫。DMEM和無血清干細胞培養基DMEM購自美國Invitrogen公司；EGF、bFGF和胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；羊抗兔CD133、羊抗鼠Bax、羊抗鼠Bcl-2和羊抗鼠cleaved caspase-3、羊抗兔GAPDH購自美國Cell Signaling公司；辣根過氧化酶標記的鼠和兔二抗購自美國Bioworld公司；蛋白提取試劑盒及細胞裂解液購自北京碧云天公司；BC200 siRNA購自上海吉瑪公司；TMZ購自美國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養、GSCs提取及TMZ處理:U87 MG細胞先以含10% FBS的DMEM培養基于培養瓶中培養，后轉至無血清的神經干細胞培養液含重組堿性成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factor，FGF）20 pg·L-1和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）20 pg·L-1中，并加入B27補充劑培養提取GSCs，GSCs以球形懸浮狀態生長。細胞均在37 ℃、5% CO2及飽和濕度的培養箱內培養傳代。以TMZ（200 μmol·L-1）處理GSCs 24 h進行后續實驗。

1.2.2 免疫熒光鑒定GSCs:GSCs在4%多聚甲醛中固定30 min后，室溫下用Triton X-100透核膜10 min。應用含5% BSA的PBS封閉2 h，于4 ℃下孵育一抗CD133（1:400）和Nestin（1:500）過夜，同時以DAPI染核。室溫孵育熒光二抗2 h，PBS洗片后應用熒光顯微鏡觀察拍照。

1.2.3 siRNA轉染:轉染前1 d，用0.5 mL含FBS和抗生素的DMEM培養基將細胞接種在24孔板上。選擇用于初期接種的細胞數量，應能在24 h內使細胞匯合達到70%～90%。轉染前換成無抗生素、無血清的培養基。siRNA的轉染濃度為40 pmol/L，準備siRNA-lipo 2000混和液，稀釋轉染試劑Lipofectamine 2000（lipo 2000），使用前將lipo 2000試劑搖勻，然后取適量，用不含血清的培養基稀釋，輕輕混和，室溫孵育5 min；用不含血清的培養基稀釋siRNA，加入量為40 pmol/L，輕輕混和；稀釋好的lipo 2000 經過5 min的孵育后，與稀釋好的siRNA輕輕混和，室溫20 min以形成siRNA-lipo 2000混和物。將siRNA-lipo 2000混和液加入含有細胞以及培養液的細胞培養板中輕輕搖晃，使之混勻。將培養板置于37 ℃的CO2培養箱中至檢測時間24 h。設立轉染對照組（NCsi）和BC200轉染沉默組（BC200 siRNA）。

1.2.4 Western blot:細胞培養融合至70%，按實驗要求處理細胞后，加入RIPA細胞裂解液（使用前20 min加蛋白酶抑制劑，使其終濃度為1 mmol·L-1），在冰上孵育15 min以充分裂解，然后在4 ℃、12 000 r/min離心15 min。取樣品上清液留用，采用BCA試劑盒進行蛋白定量。進行Western blot檢測時，每個泳道按30 μg蛋白質樣品進行上樣，SDSPAGE電泳分離蛋白，然后將分離蛋白電轉移至硝酸纖維素膜（美國Millipore公司）上；5%脫脂牛奶室溫封閉1 h后，以TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；然后按要求加入Bax（1:1 000）、cleaved caspase-3（1:1 000）、Bcl-2（1:2 000）、CD133（1:1 000）室溫雜交1～2 h或4 ℃溫育過夜。一抗處理后，TBST洗膜3次，再加入相應的辣根過氧化物酶標記二抗（1:2 000），室溫雜交1 h，PVDF膜以化學發光試劑盒（美國Millipore公司）進行顯色，Syngene Imaging System進行成像，以Quantity One對蛋白印跡條帶進行處理和分析。

1.2.5 實驗分組:實驗分為對照組（Control組）、TMZ處理組（TMZ組）、轉染對照組（NCsi組）、BC200轉染組（BC200 siRNA組）、TMZ處理的NCsi組（NCsi+TMZ組）、TMZ處理的BC200 siRNA組（BC200 siRNA+TMZ組）。

1.3 統計學處理方法 采用SPSS11.5軟件進行分析。數據以±s 表示，2組間比較用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 GSCs的分離鑒定結果 免疫熒光染色發現GSCs表面存在干細胞標記物CD133和Nestin，GSCs分離培養成功，見圖1。

圖1 GSCs表面干細胞標記物CD133和nestin的熒光顯色（免疫熒光染色）

2.2 TMZ處理對GSCs凋亡的影響 TMZ處理24 h后，TMZ組24 h GSCs成球能力未有明顯變化，見圖2。與Control組比，TMZ組細胞Bax、cleaved caspase-3、Bcl-2蛋白表達水平未有明顯變化（P＞0.05）。

圖2 TMZ對GSCs細胞形態無明顯影響（×100）

2.3 siRNA沉默BC200對GSCs干細胞標志物表達的影響 與NCsi組比，BC200 siRNA組的BC200 RNA水平下降了90.25%±3.66%，差異有統計學意義（P＜0.01）；與NCsi組比，BC200 siRNA組的CD133蛋白表達下降92.36%±4.22%，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖3。

2.4 沉默BC200對TMZ誘導的GSCs凋亡的影響 與NCsi+TMZ組比，BC200siRNA+TMZ組GSCs成球能力明顯減弱，見圖4A。與NCsi+TMZ組比，BC200 siRNA+TMZ組細胞cleaved caspase-3和Bax分別上調45.36%±4.25%和63.23%±5.12%，Bcl-2下調31.22%±3.80%，差異有統計學意義（P＜0.01），見圖4B和4C。

圖3 siRNA沉默BC200后抑制GSCs CD133蛋白表達

3 討論

圖4 沉默BC200對TMZ誘導的GSCs細胞球形生長和凋亡的影響

惡性膠質瘤是常見的中樞神經系統腫瘤，具有高侵襲性。到目前為止，傳統手術只能切除肉眼可見的膠質瘤病灶，因此術后患者往往要接受放療或化療[7]。TMZ為膠質瘤治療的一線化療藥物，是一種能高效透過血腦屏障的親脂性小分子，其藥理機制為引起堿基錯配導致DNA斷裂進而抑制腫瘤細胞生長最終導致細胞死亡[2]。研究發現，經過一段時間治療惡性膠質瘤細胞對TMZ等化療藥敏感性會降低[8]。研究報道，降低惡性腫瘤干細胞干性可增強細胞對化療藥物的敏感性[9]。腫瘤干細胞具有自我更新、無限增殖、高致瘤性等特點，近些年研究發現，腫瘤干細胞與干細胞具有某些相同的特異性表面分子標志物，例如CD133、Nestin、ESA等，且懸浮生長時均會以微球狀生長[10-11]。本研究發現干細胞培養液培養分離的GSCs表面陽性表達CD133和Nestin，細胞球狀聚集生長，驗證了其干細胞特性。TMZ處理GSCs 24 h時細胞球狀生長能力未明顯下降，凋亡標志蛋白Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2未有明顯變化，提示在24h時TMZ未能明顯誘導GSCs凋亡。

BC200是一種在人類神經細胞中特異性表達的lncRNA，通過特定的調節機制調節神經元細胞突觸小體的形成，在一般正常組織中可以檢測到較低表達量的lnc BC200[12]。研究報道，lncRNA BC200在腫瘤組織中表達量明顯升高，釋放并穩定地存在于血液中，這為其作為外周血腫瘤標志物提供了可能[13-14]。本研究進一步實驗發現，BC200高表達于腦膠質瘤U87 MG細胞，siRNA沉默BC200后，由腦膠質瘤U87 MG細胞培養分離的GSCs干細胞標志物CD133表達下調。提示GSCs干性能力下降。TMZ處理沉默BC200的GSCs發現，細胞成球能力減弱，細胞分散生長。觀察凋亡標志蛋白發現，Bax和cleaved caspase-3 表達明顯上調，Bcl-2 下調。這些提示GSCs中BC200對細胞干性的維持具有重要作用，而干細胞特性的保持使GSCs能夠抵抗TMZ誘導的細胞凋亡。

綜上所述，BC200可能通過介導Nestin表達從而維持腦膠質瘤U87 MG細胞的干性，而該效應可促進細胞對TMZ誘導凋亡的抵抗。因此，干預BC200及其下游信號靶點可能是腦膠質瘤臨床治療的新方法。