胎盤質膜脂肪酸結合蛋白與非妊娠糖尿病巨大兒發生的關聯性

韓影，王晨晨，王玉環，葉艷，閆洪濤，楊新軍

（1.溫州醫科大學 公共衛生與管理學院預防醫學系，浙江 溫州 325035；2.溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院 產科，浙江 溫州 325027）

巨大兒是指出生體質量≥4 000 g的活產新生兒[1]。近年來，全球的巨大兒發生率均呈上升趨勢[2-3]。巨大兒的發生不僅會增加肩難產等產科問題[4]，而且會增加其成年后患糖尿病、肥胖等代謝性疾病的風險[5-6]。目前國內外的研究多關注妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）巨大兒，而非GDM巨大兒發生的原因和機制仍不清楚[7]。已知長鏈多不飽和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acid，LCPUFA）對胎兒的發育具有重要作用，而且由于胎兒合成LCPUFA的能力有限，主要依靠胎盤從母體轉運給胎兒[8-9]。胎盤過度轉運脂肪酸會導致胎兒脂質水平異常，這可能是產生巨大兒或大于胎齡兒（large for gestational age，LGA）的原因之一[10]。本實驗室前期研究發現脂肪酸轉位酶在巨大兒胎盤中表達上調[11]，胎盤質膜脂肪酸結合蛋白（plasma membrane fatty acid-binding protein，FABPpm）與其他膜蛋白相比，對LCPUFA具有更高的親和力，它能夠優先攝取LCPUFA，且由于其只在胎盤母體面表達，更有利于LCPUFA從母體到胎兒的單向流動[12-13]。那么在非GDM巨大兒發生中，是否有胎盤FABPpm表達改變，影響胎盤脂肪酸過度轉運尚不清楚。因此，本研究擬探討胎盤FABPpm基因表達水平與巨大兒發生的關系，為非GDM巨大兒的發生機制提供新的線索。

1 資料和方法

1.1 一般資料 連續收集2015年6月至2016年6月在溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院產科進行常規產前檢查并分娩的產婦及單胎足月新生兒作為研究對象。巨大兒組為出生體質量≥4 000 g的新生兒；對照組為隨機選擇的出生體質量2 500～3 999 g且與巨大兒分娩時間相差3 d以內的新生兒。入選標準:正常妊娠、單胎、足月分娩，糖耐量試驗正常，新生兒無先天畸形。排除標準:有妊娠合并癥者（如糖尿病、高血壓、心臟病等）；有妊娠并發癥（如胎盤異常、先兆子癇等）和新生兒先天畸形。本研究經溫州醫科大學附屬第二醫院育英兒童醫院倫理委員會批準，所有產婦均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集:采用自行設計的調查表收集產婦和新生兒的基本信息，內容包括產婦年齡、身高、孕前體質量、孕前BMI、孕期體質量增加值、分娩方式、新生兒出生體質量及其他相關信息。

1.2.2 樣品采集與處理:胎兒娩出后采用無菌注射器抽取臍靜脈血10 mL，室溫靜置1 h，3 000 r/min離心20 min，將上層血清轉移至5 mL凍存管中；胎盤娩出后，立即取胎盤母體側滋養層組織1 cm3，放入經DEPC處理過的凍存管中，加入RNAlater（美國Ambion公司）保存。采集的樣品液氮運輸，并保存于-80 ℃冰箱待測。

1.2.3 胎盤RNA提取、反轉錄和qPCR檢測:用TRIzol法提取胎盤總RNA，反轉錄后采取qPCR法測定胎盤FABPpm表達水平，選取GAPDH作為內參基因。所用引物序列如下:FABPpm上游:5'-GGAAGGAAATAGC AACAGTGG-3'，下游:5'-TCCTACACGCTCACCATATAAGC-3'，產物片段長度為191 bp；GAPDH上游:5'-CATGAGA AGTATGACAACAGCCT-3'，下游:5'-AGTCCTTCCACGATAC CAAAG-3'，產物片段長度為113 bp。qPCR反應條件為:95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40 個循環。PCR產物經熔解曲線與瓊脂糖凝膠電泳分析，以保證產物的特異性。最后采用2-△△CT法進行數據處理。

1.2.4 Western blot法檢測胎盤組織中FABPpm表達水平:取胎盤組織用PBS洗滌2次，棄上清，加入RIPA裂解液裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白質濃度，調整濃度一致，蛋白變性后-20 ℃保存。經SDS-PAGE后，電轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉2 h，兔抗人抗體一抗（美國Abcam公司）1:2 000孵育過夜，TBST洗膜3次每次10 min，用山羊抗兔二抗（美國Abcam公司）1:5 000常溫孵育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min，使用增強化學發光液顯色，用凝膠成像系統采集圖像，采用Quantity one凝膠圖像分析系統對圖像中蛋白條帶的灰度值進行分析。

1.2.5 臍血游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）水平檢測:采用銅試劑比色法檢測，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.3 統計學處理方法 問卷調查資料和實驗數據統一錄入EpiData 3.1數據庫，運用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料如呈正態分布，則以形式表示，若非正態分布用M（P25，P75）表示。計量資料采用成組t檢驗或Mann-Whitney U檢驗；計數資料采用χ2檢驗或秩和檢驗。采用logistic回歸分析巨大兒的影響因素，以OR（95%CI）來估計各因素對巨大兒發生的危險程度。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料 2組間新生兒性別、分娩方式、孕期體質量增加和新生兒出生體質量的差異有統計學意義（P＜0.05），其他因素如產婦年齡、孕前體質量、身高、孕前BMI、孕周、初產婦的比例在2組間差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 2組產婦及新生兒的基本特征比較（每組n=40）

圖1 2組胎盤組織中FABPpm mRNA表達

2.2 胎盤FABPpm mRNA表達 qPCR檢測結果顯示，巨大兒組FABPpm mRNA表達量高于對照組，差異有統計學意義（Z=-2.519，P=0.012），見圖1。進一步按照性別分層分析顯示，在男性新生兒中，巨大兒組FABPpm mRNA表達量為1.33（1.02，1.78），高于對照組的1.03（0.91，1.23），差異有統計學意義（Z=-2.176，P＜0.001）；而在女性新生兒中，2組表達量差異無統計學意義[1.16（0.69，1.64） vs. 0.95（0.79，1.14），P＞0.05）]。

2.3 胎盤FABPpm蛋白表達水平 Western blot檢測結果顯示巨大兒組FABPpm的蛋白表達量高于對照組，差異有統計學意義（t=-3.769，P=0.002），見圖2。

2.4 2組新生兒臍血NEFA濃度比較及與FABPpm的mRNA表達的相關性 2組新生兒臍血中NEFA的含量測定結果顯示，巨大兒組為（274.72±138.08）μmol/L，低于對照組的（364.07±184.05）μmol/L（P=0.021）。相關性分析的結果顯示，胎盤FABPpm表達量與臍血NEFA濃度在對照組中呈正相關關系（rs=0.334，P=0.046），但是在巨大兒組中，未觀察到兩者的直線相關關系（見圖3）。

圖2 2組胎盤FABPpm蛋白相對表達量

2.5 胎盤FABPpm mRNA表達與新生兒出生體質量的相關性 FABPpm mRNA表達量和新生兒出生體質量的相關性分析結果顯示，2組中FABPpm mRNA均與出生體質量呈正相關，見圖4。

2.6 巨大兒發生的影響因素分析 采用多因素logistic回歸模型，對影響巨大兒發生的因素進行篩選與分析。以是否是巨大兒為因變量，其他因素如新生兒性別、孕期體質量增加、FABPpm mRNA表達量等為自變量進行logistic回歸分析。各自變量賦值情況為:①胎兒性別:女=0，男=1。②孕期體質量增加:正常=0，不足=1，過多=2，孕期體質量增加的分類依據是美國醫學研究所針對不同孕前BMI的孕婦推薦的孕期體質量增加適宜范圍[14]:孕前BMI＜18.5 kg/cm2為12.5～18 kg；孕前BMI=18.5～24.9 kg/cm2為11.5～16 kg；孕前BMI=25.0～29.9 kg/cm2為7～11.5 kg；孕前BMI≥30 kg/cm2為5～9 kg。低于推薦范圍為體質量增加不足，在推薦范圍之內的為正常，超過推薦范圍的為體質量增加過多。③FABPpm:低于中位數=0，高于中位數=1。④NEFA:低于中位數=0，高于中位數=1。在控制了新生兒性別、孕期體質量增加等因素之后，胎盤FABPpm mRNA的表達升高可增加巨大兒發生風險，且與胎兒性別、孕期體質量增加過多共同影響巨大兒的發生，見表2。

圖3 2組胎盤FABPpm mRNA表達量與臍血NEFA濃度的相關性

圖4 胎盤FABPpm基因mRNA表達水平與新生兒出生體質量的相關性分析

3 討論

本研究發現在巨大兒胎盤中FABPpm mRNA和蛋白均呈現高表達。FABPpm表達量與臍血NEFA濃度在對照組呈正相關，而在巨大兒組未顯示有意義的相關關系。多因素logistic回歸分析控制相關混雜因素后，FABPpm高表達的OR仍然具有統計學意義，提示胎盤FABPpm表達上調可增加非GDM巨大兒發生風險，其可能是通過影響了胎盤脂肪酸轉運進而影響巨大兒發生。

已知胎盤作為連接母體與胎兒的橋梁，負責將對胎兒發育必須的脂肪酸等營養物質輸送到胎兒體內。胎盤FABPpm可通過加速攝取、轉運和氧化LCPUFA來調節胎盤脂肪酸代謝過程[15-17]。那么巨大兒胎盤FABPpm基因mRNA和蛋白水平都呈高表達，可使巨大兒的胎盤具有相對更高的能力攝取并轉運母體脂肪酸給胎兒。當大量脂肪酸在胎兒體內以脂肪形式沉積，便容易獲得更多的身體脂肪和更大的體質量。另外，我們發現在男性新生兒中，巨大兒胎盤中FABPpm表達量高于對照組，而女性新生兒中，2組并無差異，這可能是由于男性新生兒比女性新生兒對脂肪酸有更高的需求[18]，使得男性巨大兒胎盤代償性地表達更多的FABPpm，才能攝取更多的脂肪酸以滿足胎兒的需求。這也可能部分地解釋了巨大兒男嬰多于女嬰的現象。

本研究發現NEFA在巨大兒臍血中含量降低，且對照組胎盤FABPpm表達與臍血NEFA濃度呈正相關關系，但在巨大兒組兩者并未發現有意義的相關性。該結果提示我們，除了胎盤的脂肪酸轉運之外，可能還有其他的因素影響胎兒臍血NEFA的含量。如有研究報道在巨大兒臍血中含有更高的胰島素[19]，而胰島素的高表達能夠促進脂肪酸的再酯化，使得巨大兒臍血中NEFA含量降低。另一個可能的影響因素是，巨大兒對脂肪酸的需求比正常胎兒更高，大量脂肪酸被巨大兒用于合成自身脂肪并沉積。由于這些影響因素的存在，所以即使上調的FABPpm攝取并轉運更多的脂肪酸給巨大兒，但是其臍血中NEFA含量卻不高，且在巨大兒組中并未觀察到FABPpm與NEFA的直線相關關系。另外，本研究還發現，胎盤FABPpm表達量與出生體質量在2組中均呈正相關關系。這說明了胎盤FABPpm的表達會增加胎盤對脂肪酸的攝取和轉運[15-17]，使胎兒獲得更多的用于脂肪合成的原料，造成體內更多的脂肪沉積，因此出生體質量會增加。

本研究分析獲得的其他影響巨大兒發生的相關因素與以往的研究結果相一致[20]，男性胎兒和孕期體質量增加過多都會增加巨大兒的發生風險。在控制了混雜因素之后，胎盤FABPpm mRNA高表達仍然會增加巨大兒發生風險，提示FABPpm作為重要調節因子可能通過影響巨大兒脂肪酸轉運而參與巨大兒的形成。

表2 巨大兒發生的影響因素

本研究也存在不足之處。首先，該研究是一項病例對照研究，不能評估各因素與巨大兒發生的因果關系。其次，由于研究的樣本量有限，多因素分析模型中危險度估計的可信區間較寬，可能會影響估計的精確性。因此，進一步的研究需要增加樣本量，并通過細胞模型和實驗動物模型探討脂肪酸在胎盤中轉運的具體機制，從而幫助我們深入了解胎盤脂肪酸轉運代謝相關蛋白在巨大兒發生中的作用。

綜上所述，胎盤FABPpm mRNA和蛋白表達上調，會增加巨大兒發生風險。提示可能是由于FABPpm參與了胎盤脂肪酸的轉運從而調節新生兒出生體質量，進而影響巨大兒發生。該結果為探索非GDM巨大兒發生機制提供了新的線索。