僅女性發(fā)病的Leber遺傳性視神經(jīng)病變家系的表型分析

呂媛媛，徐曼，張娟娟，管敏鑫

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院，浙江 溫州 325027）

Leber遺傳性視神經(jīng)病變（Leber's hereditary optic neuropathy，LHON）是一種母系遺傳病。1871年，德國(guó)眼科醫(yī)師Leber首次對(duì)其臨床特征作了相應(yīng)描述:此病好發(fā)于青壯年男性，雙眼可表現(xiàn)同時(shí)或先后急性或亞急性無(wú)痛性視力減退，可能伴隨著中心視野缺失及色覺(jué)障礙[1-4]。典型的LHON首發(fā)癥狀是視物模糊，隨后的幾個(gè)月之內(nèi)出現(xiàn)無(wú)痛性、完全或接近完全的失明。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞退行性變是LHON的主要病理特性[5]。LHON和線粒體功能異常之間存在著密切關(guān)系，線粒體DNA的突變是這種疾病的分子基礎(chǔ)[2，6-7]。已報(bào)道，MT-ND1 3460G＞A、MT-ND1 11778G＞A和MT-ND1 14484T＞C突變存在于一些國(guó)家近90%的LHON家系當(dāng)中，這3個(gè)LHON原發(fā)性位點(diǎn)參與編碼呼吸鏈復(fù)合體I的亞基[2，8]。但是，LHON相關(guān)的3 個(gè)原發(fā)性突變位點(diǎn)（m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C）本身尚并不足以導(dǎo)致LHON的臨床表現(xiàn)。這也就合理地解釋了為什么在一個(gè)家系中或不同家系之間的母系親屬，盡管他們攜帶相同LHON相關(guān)的線粒體DNA突變，但視力損傷方面卻表現(xiàn)出不同的嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡和外顯率。因此，其他的一些環(huán)境因素及遺傳因素（如核基因修飾、線粒體單體型等）可能參與LHON相關(guān)的線粒體DNA突變相關(guān)的視覺(jué)損害的表型表現(xiàn)的調(diào)節(jié)[2-3]。此外，LHON患者家系的典型特征是男性偏倚，而本研究的11個(gè)LHON家系僅累及了母系女性成員，這些女性成員表現(xiàn)出LHON的臨床特征。且對(duì)以上女性患者進(jìn)行線粒體全基因組分析，鑒定她們的確攜帶線粒體ND4 11778G＞A突變。為探索其他環(huán)境因素或遺傳因素對(duì)LHON表型的影響，我們進(jìn)一步對(duì)所有系譜中的母系成員進(jìn)行線粒體全序分析及線粒體單體型分析。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2008年5月至2014年10月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院、河北省眼科醫(yī)院、北京中醫(yī)藥大學(xué)東方眼科醫(yī)院、福建東南眼科醫(yī)院等全國(guó)各地多家醫(yī)院的LHON患者，采集他們的外周靜脈血液并收集相應(yīng)的臨床資料。對(duì)收集的1 362例漢族LHON患者的MT-ND4基因進(jìn)行了系統(tǒng)篩查，線粒體全基因組測(cè)序分析獲得11位攜帶11778G＞A突變的LHON患者，并對(duì)患者所在家系進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序分析。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受檢者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 眼科檢查:對(duì)收集的系譜中的先證者及其他成員進(jìn)行眼科檢查，包括視力、視野、色覺(jué)檢查、眼底、壓力、瞳孔對(duì)光反射、視覺(jué)誘發(fā)電位、眼底成像等。根據(jù)WHO定義的視力損傷程度的標(biāo)準(zhǔn):輕度（一級(jí)視力損傷）:0.3～0.1；中度（二級(jí)視力損傷）:0.1～0.05；重度（三級(jí)視力損傷）:0.05～0.02；極重度（四級(jí)視力損傷）:小于0.02。

1.2.2 線粒體基因組突變分析:從受檢者的外周靜脈血中提取基因組DNA（經(jīng)典酚氯仿手工法提取），提取的基因組DNA進(jìn)行濃度和純度檢測(cè)（Nano Drop 2000，美國(guó)Thermo Fisher公司）。以提取的DNA作為PCR模板，按照PCR體系加入10×PCR buffer，dNTPs，正、反向引物，Mg2+，Taq酶，ddH2O各成分并混勻，置于PCR儀進(jìn)行反應(yīng)。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃5 min，95 ℃ 45 s，Tm 59 ℃ 45 s，72 ℃1 min/kb，35個(gè)循環(huán)，72 ℃ 8 min。

11位先證者的線粒體基因組在一套輕（L）鏈和重（H）鏈寡核苷酸引物作用下在24個(gè)重疊片段中進(jìn)行PCR擴(kuò)增[9]。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)一步純化后用24對(duì)正反向引物進(jìn)行線粒體基因組測(cè)序。最后，通過(guò)Codon Code序列分析軟件將測(cè)得的先證者的線粒體全序列與修正的mtDNA劍橋參考序列（Cambridge reference sequence，rCRS，NC_012920.1）[10]進(jìn)行對(duì)比分析。

1.2.3 線粒體單體型分析:全序分析攜帶11778G＞A突變的11位先證者通過(guò)線粒體單體型命名法歸類(lèi)到亞洲線粒體單體型[11-12]。

1.2.4 保守性分析:基因保守性是指某一段序列在進(jìn)化演變的過(guò)程中，在不同的物種都一直保留。這樣的基因一定發(fā)揮著很重要的功能，并且有其不可代替性。因此為分析該位點(diǎn)的保守性，我們使用了17個(gè)脊椎動(dòng)物的線粒體DNA序列來(lái)進(jìn)行種間分析，包括小鼠、人、牛、節(jié)尾狐猴、卷尾猴、白手長(zhǎng)臂猿、大猩猩、獼猴、地中海獼猴、倭黑猩猩、猩猩、蜂猴、蘇門(mén)答臘猩猩、阿拉伯狒狒、黑猩猩、馬來(lái)跗猴、爪蟾。通過(guò)對(duì)比人和其他16種脊椎動(dòng)物的核苷酸變異計(jì)算得出該位點(diǎn)的保守性。即在17種脊椎動(dòng)物中該位點(diǎn)具有野生型核苷酸的物種的百分比。

2 結(jié)果

2.1 臨床表現(xiàn) 先證者（WZ300-III-2、WZ327-IV-1、WZ415-IV-3、WZ883-IV-1、WZ1232-III-1、WZ1234-IV-3、WZ1245-III-1、WZ1391-III-1、WZ1420-III-1、WZ1427-III-6、WZ1448-II-3）分別在10、7、9、13、16、13、10、9、7、17、25歲時(shí)無(wú)痛性雙眼視力下降，先是單側(cè)視力下降，1～2周后對(duì)側(cè)視力下降，中心視野缺損，色覺(jué)障礙。對(duì)先證者們分別進(jìn)行眼科檢查，視力損傷檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1，患者發(fā)病時(shí)的視力損傷程度由輕度到極重度不等。個(gè)別視力損傷嚴(yán)重的患者眼底圖見(jiàn)圖1，家系圖見(jiàn)圖2。同時(shí)我們還對(duì)先證者所在家系成員進(jìn)行臨床評(píng)估，先證者及其家系中患者皆為女性，發(fā)病年齡為9～26（12.4±4.8）歲；家系外顯率為6.7%～25.0%，每個(gè)家系平均15.90%±0.08%；11個(gè)家系合計(jì)總的外顯率為14.5%（見(jiàn)表2）。

表1 11例家系先證者臨床資料

圖1 3例患者和1名正常對(duì)照的眼底圖像

圖2 11例患者的家系圖

表2 11例家系患者臨床資料總結(jié)

進(jìn)一步對(duì)11個(gè)家系中所有成員進(jìn)行了全面的病史、體格檢查和眼科檢查，結(jié)果表明，這些家系先證者和其他成員并未表現(xiàn)出其他的臨床異常，如糖尿病、肌肉疾病、聽(tīng)力障礙和神經(jīng)紊亂等臨床癥狀。因此，沒(méi)有其他相關(guān)證據(jù)或機(jī)制來(lái)影響家系中患者的視力損傷。

2.2 線粒體基因組分析 母系成員視力出現(xiàn)障礙會(huì)讓我們聯(lián)想到線粒體疾病，因?yàn)榫€粒體疾病的遺傳方式即母系遺傳。因此，我們通過(guò)提取血液DNA進(jìn)行線粒體24對(duì)引物PCR擴(kuò)增技術(shù)來(lái)對(duì)11位先證者進(jìn)行線粒體全序檢測(cè)分析。首先檢測(cè)LHON相關(guān)的3個(gè)原發(fā)性位點(diǎn)（m.3460G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C），結(jié)果發(fā)現(xiàn)11位先證者均攜帶了m.11778G＞A突變。通過(guò)對(duì)比先證者們的線粒體全序和修正的mtDNA劍橋參考序列[10]發(fā)現(xiàn):在這些先證者線粒體基因的核苷酸突變中，D-loop區(qū)有44個(gè)變異；12S rRNA編碼區(qū)有5個(gè)變異；16S rRNA編碼區(qū)有3個(gè)變異；tRNAGln、tRNAMet、tRNAAla、tRNACys、tRNAGlu編碼區(qū)各1個(gè)變異；NC非編碼區(qū)1個(gè)變異；氨基酸編碼區(qū)95個(gè)變異（其中同義突變69個(gè)，錯(cuò)義突變26個(gè)），共計(jì)153個(gè)變異位點(diǎn)。此外，我們還針對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)進(jìn)行保守性評(píng)估，對(duì)其他16種脊椎動(dòng)物中的這些序列和變異點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，進(jìn)一步評(píng)估這些RNA和編碼區(qū)中的變異點(diǎn)，通過(guò)人與其他16種脊椎動(dòng)物的核苷酸變異進(jìn)行比較計(jì)算出該位點(diǎn)的保守性指數(shù)。RNA上的變異點(diǎn)及保守性見(jiàn)表3，氨基酸編碼區(qū)的錯(cuò)義突變位點(diǎn)及保守性見(jiàn)表4。

表3 D-loop區(qū)及RNA上變異位點(diǎn)總結(jié)

2.3 線粒體單倍體型分析 線粒體DNA與核基因不同，首先線粒體DNA缺乏組蛋白保護(hù)而呈現(xiàn)裸露的閉合雙環(huán)狀結(jié)構(gòu)，使其易被損傷；同時(shí)線粒體是呼吸重要場(chǎng)所，處于高超氧化物的環(huán)境下更易受到損傷；并且缺乏有效DNA修復(fù)機(jī)制，修復(fù)能力非常有限[13]。線粒體DNA突變隨著放射狀母系而積累。當(dāng)線粒體DNA獲得功能性的突變有益于在特定環(huán)境中生存，于是這種線粒體DNA得到選擇性的富集，并在這樣的環(huán)境中形成了一組線粒體DNA單體型相關(guān)的群體，被稱(chēng)為單倍群[14]。它們組成了線粒體多態(tài)樹(shù)的主要分支，并以發(fā)現(xiàn)的先后對(duì)照字母的順序命名（A到Z）[15]。本研究的11個(gè)家系的先證者分別屬亞洲線粒體單體型B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1和M10。

3 討論

本研究對(duì)11個(gè)LHON家系的臨床、遺傳、分子特征進(jìn)行了詳細(xì)地研究。視神經(jīng)病變?yōu)槲ㄒ坏呐R床表型僅存在于攜帶相同質(zhì)性MT-ND4 11778G＞A突變家系的母系成員中，說(shuō)明線粒體基因突變是該病的分子基礎(chǔ)。而此處令人驚訝的是11個(gè)家系中共有18人出現(xiàn)視神經(jīng)性病變，而這18位患者皆為女性。這一現(xiàn)象與德國(guó)眼科醫(yī)師Leber對(duì)LHON所作出的臨床特征描述—偏倚青壯年男性[1-4]有所不符。而且，我們可以看到11 個(gè)家系中患者的發(fā)病年齡和發(fā)病時(shí)視力損傷程度及外顯率都相差較大，雖然這些患者都有快速、無(wú)痛、雙側(cè)中樞視力喪失的共同的特點(diǎn)。家系內(nèi)（數(shù)據(jù)未展示）和家系間的母系親屬表型變異范圍廣泛，包括嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡和視力障礙外顯率等，表明在LHON相關(guān)的m.11778G＞A突變表型表現(xiàn)中涉及到其他修飾因子（包括核修飾因子、線粒體單倍型、表觀遺傳和環(huán)境因素）的參與。早在之前的報(bào)道中就有提及LHON的男性?xún)?yōu)勢(shì)、外顯率較低、女性發(fā)病較遲等幾個(gè)線粒體遺傳而無(wú)法解釋的特點(diǎn)[16]。因?yàn)槟行愿叨绕惺沟肵染色體連鎖和線粒體基因被緊密聯(lián)系在一起[16-18]。有學(xué)者曾提出假說(shuō):認(rèn)為L(zhǎng)HON這種疾病可能是X基因與線粒體DNA缺陷相互作用的結(jié)果[18]。HUDSON等[19]則定義了一個(gè)X染色體單倍體與特定的MTND突變相互作用，導(dǎo)致最常見(jiàn)的mtDNA疾病LHON的視力損傷。因此，我們也可以確定這11個(gè)家系中的母系女性患者的發(fā)病也涉及其他修飾因子的參與。

表4 蛋白編碼區(qū)變異位點(diǎn)總結(jié)

在諸多修飾因子中，線粒體單倍體型也曾被提及與LHON有著一定的聯(lián)系。線粒體單倍體型A、B、F、J1、J2、M、M7B1'2、M10a有增加LHON的風(fēng)險(xiǎn)，而線粒體單體型H和M8a則扮演著“保護(hù)因子”的角色[15，20]。其中，在意大利人群中單體型J（一種歐洲人特異單體型）有增加m.11778G＞A和m.14484T＞C突變的傾向。反過(guò)來(lái)，在單體型J上發(fā)生m.11778G＞A或（和）m.14484T＞C突變會(huì)增加LHON的外顯率[21]。并且線粒體單體型J不同的亞型在LHON表達(dá)中發(fā)揮作用不同，單體型J2會(huì)增加m.11778G＞A突變攜帶者視力損傷的風(fēng)險(xiǎn)率，而單體型J1則會(huì)增加m.14484T＞C突變攜帶者的視力損傷的風(fēng)險(xiǎn)率。單體型H作為“保護(hù)因子”可以降低m.11778G＞A突變攜帶者的LHON外顯率[20，22]。本研究11個(gè)家系先證者的單體型分別為B5a、Z、N9、B4c1b、G2h、B5a、M7b、N9a10、C7b、M7b1、M10，都屬于亞洲人群的單體型。雖然，其他線粒體單體型（除J單體型）目前并沒(méi)有報(bào)道與m.11778G＞A突變有較為強(qiáng)烈的偏向性，但也不排除其他線粒體單體型對(duì)攜帶m.11778G＞A突變的患者表型變異（包括嚴(yán)重程度、發(fā)病年齡和視力障礙外顯率等）存在一定的影響。

當(dāng)然，除了線粒體單體型外，11個(gè)家系中的患者表型差異也可能與其不良的生活習(xí)慣（抽煙、酗酒、吸毒等）、工作壓力和精神狀態(tài)（抑郁、孤僻等）等環(huán)境因素相關(guān)[23-24]；另外，也不排除患者的核基因修飾[19，25-26]或繼發(fā)性位點(diǎn)突變也在LHON的生理病理過(guò)程中發(fā)揮了相應(yīng)的作用。

綜上所述，線粒體基因突變相關(guān)的LHON是一種多因素疾病，單純的原發(fā)性位點(diǎn)（m.3640G＞A、m.11778G＞A、m.14484T＞C）突變并不一定會(huì)引起視力損傷的臨床癥狀（即LHON的不完全外顯性），但原發(fā)性位點(diǎn)突變是視神經(jīng)萎縮的一個(gè)危險(xiǎn)因素[27]。伴隨著核基因修飾、特異性線粒體單倍體型、不良生活環(huán)境或繼發(fā)性突變位點(diǎn)的相互作用就有可能會(huì)增加LHON的外顯率。