結(jié)直腸癌AIM2和血清CEA表達(dá)水平及其臨床意義

趙建峰 李記彬 石剛 喬鋆 張睿

結(jié)直腸癌是惡性程度較高的消化道腫瘤，近年來(lái)結(jié)直腸癌的發(fā)生率和死亡率不斷上升，臨床也對(duì)結(jié)直腸癌的防治研究加強(qiáng)了重視［1］。如今腫瘤標(biāo)志物在癌癥患者的早期診斷和療效評(píng)估上受到了關(guān)注。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是結(jié)直腸癌診斷與預(yù)后評(píng)估的重要實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，近期研究表明其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中扮演重要角色［2-4］。黑色素瘤缺乏因子2（absent in melanoma 2，AIM2）作為IFI20X_IFI16蛋白家族成員之一，在黑色素瘤、前列腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等均有異常表達(dá)。國(guó)外學(xué)者研究指出，AIM2的表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌病例的預(yù)后不良存在密切關(guān)系［4］。為此，本研究探討了CEA和AIM2在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

資料與方法

一、臨床資料

118例結(jié)直腸癌及其50例癌旁正常組織標(biāo)本（距離腫瘤外緣5 cm）取自我院2010年1月～2013年3月收治的結(jié)直腸癌患者。其中男性74例，女性44例，年齡24～85歲，平均（68.3±9.5）歲，依據(jù)AJCC腫瘤分期標(biāo)準(zhǔn)術(shù)后TNM分期：Ⅰ期16例，Ⅱ期53例，Ⅲ期49例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者術(shù)后均經(jīng)病理學(xué)確診為結(jié)直腸癌；②術(shù)前未進(jìn)行化療、放療及免疫治療；③自愿加入試驗(yàn)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①自身免疫性疾病患者；②感染性疾病患者。

二、實(shí)驗(yàn)方法

采用免疫組織化學(xué)法測(cè)定組織中AIM2的表達(dá)：手術(shù)中切除標(biāo)本立即常規(guī)福爾馬林固定，取材，常規(guī)石蠟包埋，制片。切片經(jīng)脫蠟水化后，滴加3%過(guò)氧化氫，在含有煮沸的檸檬酸修復(fù)液的修復(fù)盒中進(jìn)行抗原修復(fù)，封閉液37 ℃濕盒孵育30 min。滴加一抗，于4 ℃冰箱過(guò)夜，次日加入生物素標(biāo)記的二抗，置于37 ℃保溫箱20 min。PBS緩沖液沖洗，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水透明和中性樹膠封片。組織染色的結(jié)果依據(jù)染色強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)定：（1）依據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比：0級(jí)（陽(yáng)性細(xì)胞≤5%）、1級(jí)（陽(yáng)性細(xì)胞5%～25%）、2級(jí)（陽(yáng)性細(xì)胞25%～50%）、3級(jí)（為陽(yáng)性細(xì)胞50%～75%）、4級(jí)（陽(yáng)性細(xì)胞＞75%）；（2）依據(jù)染色強(qiáng)度：0級(jí)（無(wú)褐色染色）、1級(jí)（淺棕色）、2級(jí)（棕色）和3級(jí)（深棕色）。最后由陽(yáng)性細(xì)胞百分比和染色強(qiáng)度分?jǐn)?shù)共同決定，兩者相乘即為最終染色評(píng)分：（陰性0）、＋（1～4）、＋＋（5～8）和＋＋＋（9～12）。-和＋代表低表達(dá)，＋＋以及＋＋＋代表高表達(dá)。兔抗人多克隆抗體 AIM2（ab93015）購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；濃縮型DAB試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

術(shù)前通過(guò)電化學(xué)發(fā)光法（ECUA）測(cè)定的血清CEA水平：所有研究對(duì)象均于清晨空腹抽取靜脈血3 mL，置于凝血酶促凝生化管，分離血清后，采用ECUA法，通過(guò)羅氏e411電化學(xué)發(fā)光分析儀測(cè)定血清CEA水平。所有操作均嚴(yán)格根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行。血清CEA≥6.50 ng/mL即陽(yáng)性。

三、觀察指標(biāo)

回顧性搜集患者臨床病理參數(shù)，包括患者的年齡、性別、腫瘤大小、部位、浸潤(rùn)深度、TNM分期、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。分析癌組織中AIM2表達(dá)水平和血清CEA水平的相關(guān)性，并分析兩種指標(biāo)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

收集患者的總生存時(shí)間，即手術(shù)治療日期至末次隨訪日（2018年5月30日）或死亡時(shí)間。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

研究所得數(shù)據(jù)均采取SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。其中，計(jì)量資料用（）的形式表示，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料組間比較應(yīng)用χ2檢驗(yàn)，Spearman等級(jí)相關(guān)分析對(duì)AIM2表達(dá)與血清CEA水平進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、結(jié)直腸癌組織AIM2和血清CEA表達(dá)

本次研究結(jié)果中，有42例（35.59%）腫瘤組織AIM2呈高表達(dá)，有39例（78.0%）癌旁正常組織AIM2呈高表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=25.295，P＜0.05）。見(jiàn)表1。結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清CEA陽(yáng)性率為44.07%（52/118）。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織AIM2和血清CEA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.660，P＜0.001）。

表1 腫瘤組織癌旁正常組織與AIM2表達(dá)［例（%）］

二、癌組織AIM2及血清CEA與臨床參數(shù)的關(guān)系

癌組織AIM2表達(dá)水平在腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移上有明顯差異（χ2=4.847，7.794，3.961；P＜0.05）。見(jiàn)表2?；颊咝g(shù)前血清CEA水平在腫瘤的大小、TNM分期以及分化程度上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=17.14，5.779，5.293；P＜0.05）。見(jiàn)表3。

三、結(jié)直腸癌AIM2和血清CEA表達(dá)水平與預(yù)后關(guān)系

K-M生存分析顯示，AIM2高表達(dá)患者5年總生存率（66.67%）明顯高于低表達(dá)患者（48.68%）；平均生存時(shí)間分別為（74.00±3.04）和（63.41±3.39）個(gè)月，（t=16.841，P＜0.001）（見(jiàn)圖1）。與術(shù)前CEA陽(yáng)性患者總生存率（44.23%）相比，陰性患者的生存率明顯更高，為73.08%。CEA陽(yáng)性和陰性患者平均生存時(shí)間分別為（60.40±3.27）和（74.12±3.46）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=21.906，P＜0.001）（見(jiàn)圖2）。聯(lián)合分析結(jié)果顯示，AIM2高表達(dá)聯(lián)合CEA陰性總生存率（63.16%）明顯高于AIM2低表達(dá)聯(lián)合CEA陽(yáng)性總生存率（39.58%）；平均生存時(shí)間分別為（72.51±3.25）和（57.67±3.29）個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.885，P＜0.001）。見(jiàn)圖3。

表2 癌組織AIM2與臨床參數(shù)的關(guān)系［例（%）］

討 論

結(jié)直腸癌起病隱匿，進(jìn)展快，多數(shù)患者入院就診時(shí)已處于中晚期，存在亞臨床腫瘤微轉(zhuǎn)移，不利于預(yù)后［5-6］。早期診斷，采取有效治療或干預(yù)措施是取得良好預(yù)后非常重要的前提。為此，一直以來(lái)探尋療效評(píng)估的腫瘤標(biāo)志物成為了臨床研究的焦點(diǎn)。

表3 患者血清術(shù)前CEA水平與臨床參數(shù)的關(guān)系［例（%）］

圖1 AIM2高表達(dá)和低表達(dá)組生存曲線

圖2 術(shù)前CEA陽(yáng)性和陰性組生存曲線

圖3 AIM2高表達(dá)聯(lián)合CEA陰性與AIM2低表達(dá)聯(lián)合CEA陽(yáng)性生存曲線

AIM2最早在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，是模式識(shí)別受體，相關(guān)研究表明，AIM2炎性小體可釋放IL-1β和IL-18等炎性因子，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答［7-8］。早期認(rèn)為，該指標(biāo)是腫瘤抑制因子，其過(guò)表達(dá)能夠抑制纖維原細(xì)胞的增殖。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)AIM2在口腔鱗狀細(xì)胞癌、鼻咽癌等、肺腺癌中呈高表達(dá)，在肝癌、乳腺癌和前列腺癌中呈低表達(dá)。在子宮內(nèi)膜癌、結(jié)直腸癌中存在AIM2基因的移碼與錯(cuò)義突變［9］。本研究結(jié)果顯示，AIM2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)率明顯低于癌旁正常組織，比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步分析AIM2表達(dá)水平與腫瘤的浸潤(rùn)深度、TNM分期以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，提示結(jié)直腸癌組織AIM2表達(dá)缺失與結(jié)直腸癌進(jìn)展及腫瘤分期有關(guān)。在抗腫瘤免疫應(yīng)答中，胞內(nèi)DNA 傳感通路發(fā)揮著重要的作用，AIM2就是其中之一，可視作識(shí)別有免疫原性的DNA疫苗，增強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答［10-11］。

CEA是一種糖蛋白，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃避、擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移中扮演著重要的角色［12-13］。如今，血清CEA在結(jié)直腸癌的術(shù)前評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)中得到了廣泛應(yīng)用，尤其在腫瘤復(fù)發(fā)監(jiān)測(cè)方面。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清CEA陽(yáng)性率為44.07%，術(shù)前血清CEA水平與腫瘤大小、TNM分期以及分化程度相關(guān)。Spearman等級(jí)相關(guān)性分析結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織AIM2和血清CEA表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。提示血清CEA水平與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)CEA促癌作用與TGF-β信號(hào)途徑存在密切關(guān)系，CEA能夠抑制TGF-β信號(hào)途徑［14］。而且相關(guān)研究指出CEA能夠抑制NK對(duì)癌細(xì)胞的殺傷并促其凋亡［15］。這些研究結(jié)果可能會(huì)對(duì)結(jié)直腸癌的治療提供參考，現(xiàn)如今CEA基因瘤苗的研制為結(jié)直腸癌免疫治療指明了新方向。本研究中癌組織中AIM2高表達(dá)聯(lián)合CEA陰性者的臨床預(yù)后明顯優(yōu)于AIM2低表達(dá)聯(lián)合CEA陽(yáng)性，提示聯(lián)合分析兩個(gè)指標(biāo)有助于評(píng)估結(jié)直腸癌患者預(yù)后。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者AIM2和血清CEA表達(dá)可能與結(jié)直腸癌的進(jìn)展有關(guān)，并且聯(lián)合兩個(gè)指標(biāo)在評(píng)估患者預(yù)后具有一定價(jià)值。