利用表面預烯基化納米硅膠顆粒制備新型液相色譜整體柱

李金祥，楊芮萌，李 佳，馬世雍

(遼寧師范大學化學化工學院，遼寧大連 116029)

毛細管液相色譜由于其柱效高，重復性好，樣品和溶劑消耗低，分離過程中色譜稀釋度大大降低，與質譜聯用相容性好等優點在分離領域受到越來越多的關注[1-2]，現如今，除了生物學以及藥學之外，醫學行業也大量應用了這一技術[3-4]。當填充到整體柱里面的固定相填料變化的時候，能夠把整體柱一共劃分成3個不同的類型，分別是有機聚合物整體柱、無機二氧化硅整體柱以及有機與無機雜化整體柱。有機聚合物整體柱盡管制備起來難度較低，但在有機溶劑中極易溶脹；無機二氧化硅整體柱制備需要花費大量的時間，并且表面改性所涉及的工作量也十分繁雜；有機與無機雜化整體柱克服了上述的缺點并結合了兩者的優點，因此廣泛地應用于毛細管液相色譜領域。

在本次研究當中，所使用的交聯劑為表面預烯基化的無機納米硅膠顆粒，該交聯劑的直徑為20～50 nm，2-二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯(DAMA)與甲基丙烯酸(MAA)作為有機功能單體，在毛細管(外徑375 μm，內徑150 μm)內原位聚合，成功得到了有機與無機雜化兩性離子交換整體柱。除此以外，本次研究的測試對象為一價無機陰離子以及有機胺類陽離子各一組，使用這兩個測試對象對整體柱的分離性能進行了全面地評估。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

本實驗所需用到主要儀器見表1,所用試劑和材料見表2。

表1 實驗所用儀器

表2 實驗所用試劑和材料

1.2 納米硅膠顆粒表面預烯基化處理

實驗中使用的納米硅膠顆粒是按照文獻[5]報道，采用油包水反相微乳法合成的二氧化硅納米顆粒，其直徑在20～50 nm之間。將納米顆粒用1.0 mol·L-1NaOH溶液浸泡60 min，高速離心后用超純水浸泡60 min，洗到中性，用1.0 mol·L-1HCl溶液浸泡60 min，高速離心后用超純水浸泡60 min，洗到中性，最后加入甲醇，浸泡約30 min后使用烘箱烘干。量取相同體積的預烯基化試劑γ-MAPS與甲醇，制成混合溶液，注入納米顆粒中，放入恒溫水浴中，溫度控制在45℃，反應12 h。高速離心后用甲醇浸泡60 min，最后放入烘箱烘干。

1.3 毛細管內壁預烯基化處理

將內徑150 μm的毛細管內壁進行預烯基化處理，具體方法同納米硅膠顆粒預烯基化處理。

1.4 整體柱的制備

共需要配制3種溶液，分別為甲、乙、丙。甲溶液是一種三元致孔劑，其組分為水、甲醇以及環己醇，(H2O∶MeOH∶CyOH=l∶l∶2，v/v/v)，乙是有機單體混合溶液(DAMA∶MAA=1∶1，v/v)，丙是用甲溶液配制的濃度為2%(w/v)的AIBN溶液。3種溶液均需要通入氮氣除氧,然后再使用超聲來進行振蕩。稱取7.5 mg表面預烯基化的納米硅膠顆粒，22.5 μL乙溶液和60 μL甲溶液于1.5 mL的離心管中,通入氮氣除氧，并使用超聲振蕩，再加入10 μL丙溶液后，通入氮氣并超聲振蕩30 s，由此獲得均勻的聚合反應液[6]。在注射器中添加一定量的聚合反應液，并快速把它注入到經過預處理的毛細管里，之后把毛細管的兩側都密封，放置在恒溫水浴里，溫度控制在60℃，反應10 h，接著再用甲醇以及水對整體柱進行沖洗，水與甲醇的量要超過柱體積的50倍。最后可得到有機與無機雜化兩性離子交換整體柱。

2 結果與討論

2.1 整體柱制備條件的優化

為了制備固定相結實耐壓，孔隙均勻滲透性好，分離效能高的兩性離子雜化整體柱，本研究對整體柱的制備條件進行了嚴格設計，對聚合反應時間、單體的總濃度以及致孔劑的組成配比等進行了深入研究。聚合混合物一共由幾種物質所構成，分別為：納米硅膠顆粒(7.5 mg)+DAMA(11.25 μL)+MAA(11.25 μL)+環己醇(35 μL)+甲醇(17.5 μL)+水(17.5 μL)+AIBN(0.2 mg)；反應溫度：60℃；反應時間：10 h。

2.2 色譜分離

對于兩性整體固定相而言，它同時擁有-NH2與-COOH兩種基團，對流動相的酸堿度進行調整之后，可控制上述兩個基團質子化程度。當pH改變之后，固定相表層的電子密度以及電荷性質也會受到影響，所以，實現了陰離子分離模式和陽離子分離模式的轉換。

2.2.1 陰離子分離

(a)pH=3

(b)pH=3.3

(c)pH=3.6

(d)pH=3.9

(a)[CI-]=50 mmol·L-1

(b)[CI-]=70 mmol·L-1

(c)[CI-]=90 mmol·L-1

(d)[CI-]=110 mmol·L-1

由圖3可見，通過調節流動相pH值和競爭離子濃度，可利用較短的整體柱(1 cm)在較短的時間(3 min)實現3種陰離子的快速分離。具體實驗條件為:紫外檢測波長210 nm；有效柱長1 cm；流動相：10 mmol·L-1H3PO4-NaH2PO4緩沖溶液，pH=3.6，[Cl-]=90 mmol·L-1；流速：0.9 μL·min-1。

圖3 三種陰離子的快速分離圖

2.2.2 有機陽離子分離

流動相在堿性條件下，-NH2的質子化程度會比-COOH更小，固定相整體帶負電荷，所以此時可借助靜電作用來分離陽離子。本研究的流動相為H3PO4-Na2HPO4緩沖溶液，溶液濃度為20 mmol·L-1，通過調節pH值的變化來考察對3種有機胺類陽離子保留時間的影響，具體實驗條件：紫外檢測波長214 nm；有效柱長4.5 cm；流動相：20 mmol·L-1H3PO4-Na2HPO4緩沖溶液，40%ACN；流速：0.8 μL·min-1。組分：(1)對甲苯胺；(2)對氯苯胺；(3)對硝基苯胺。由圖4可見，隨著pH值的增加，3種有機陽離子保留時間增加。

(a)pH=7

(b)pH=8

(c)pH=9

在堿性條件下，有機胺類陽離子的分離機理較復雜，除與陽離子的靜電作用外，固定相的親水性同樣對陽離子的保留時間有一定的影響，具體實驗條件為：紫外檢測波長214 nm；有效柱長4.5 cm；流動相：20 mmol·L-1H3PO4-Na2HPO4緩沖溶液，pH=7；流速：0.8 μL·min-1；組分：(1)對甲苯胺；(2)對氯苯胺；(3)對硝基苯胺。由圖5可見，由于陽離子與固定相間存在著親水作用，提高流動相里乙腈占比，固定相與陽離子兩者間的相互作用力會有所削減，因此分離效果不佳。進而可以證明有機胺類陽離子與固定相之間為離子交換機理和親水作用的共同作用。

(a)30%ACN

(b)40%ACN

(c)50%ACN

通過上述實驗可知，對流動相的酸堿度以及其中添加劑的占比進行改變，就能夠讓有機胺類陽離子在較短的時間內實現分離，具體實驗條件為：紫外檢測波長214 nm；有效柱長4.5 cm；流動相：20 mmol·L-1H3PO4-Na2HPO4緩沖溶液，pH=7，40%ACN；流速：0.8 μL·min-1。組分：(1)對甲苯胺；(2)對氯苯胺；(3)對硝基苯胺。由圖6可見，利用較短的整體柱(有效柱長4.5 cm)可在較短時間(5 min)內實現快速分離。

圖6 三種有機胺陽離子的快速分離圖

3 結論

利用表面預烯基化的無機納米硅膠顆粒作為交聯劑，含有-COOH基團的甲基丙烯酸和含有-NH2基團的2-二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯作為有機功能單體，在毛細管里面，進行原位聚合反應，可得到一種全新的有機無機雜化兩性離子交換整體柱。利用整體柱分離了一組無機陰離子和一組有機陽離子。